隨著人類基因組計劃（human genome project
）在2003年順利完成，基因組測序技術取得了長足的進步，這直接導致了每兆基因組成本的大幅下降以及檢測的基因組數量越來越多。人們對基因組的復雜性深感震驚，這也引導著測序技術的進一步發展。最近的一些突破性技術使得測序技術在更短的時間內可以獲得更多的數據量。與之對應的是，還有一些技術的進步使得單條序列的測序讀長變得更長——這對解析結構性的復合區段是極其必要的。這些進展給科研人員以及醫療診斷人員提供了一個絕佳的平臺使得人們對基因組變異導致的表型變化以及疾病發生有了進一步的了解。
近日，美國冷泉港實驗室聯合加州大學戴維斯分校的研究人員在國際著名評論型綜述雜志Nature Reviews Genetics（影響因子41）上發表了一篇評論型綜述。該綜述對高通量測序的技術原理以及各平臺的優勢比較和實踐應用進行了深入淺出的分析。
介紹
自從DNA的雙螺旋結構被人們解析開始1，人們在探究健康與疾病的基因組的復雜性與差異性上做出了巨大的努力。為了支持人類基因組計劃的順利進行2，人們在儀器和試劑上做出了巨大的改進。該計劃的完成使得人們強烈的意識到人們需要更多更好的技術與數據分析能力來回答隨之而來的一系列生物學問題。然而，通量的限制以及居高不下的測序成本成為了人們進一步了解基因組的一道坎。2000年之后推出的高通量測序平臺很好地解決了這個問題，人類基因組測序的成本直接因此下降50000倍，并且由此產生了一個新的名詞：下一代測序（next-generation
sequencing，NGS）3。在過去的十年中，NGS技術不停的在進步——測序的數據量增加了100-1000倍4。這些技術上的進展使得人們甚至可以在一條read上讀出整條基因組序列。根據Veritas
Genomics的數據5，人類基因組測序的成本也已經下降到1000美元/人。不僅如此，該技術已經廣泛在臨床診斷上得到應用3,6。
但是，盡管NGS技術非常重要，卻并非完美。與NGS技術一道出現的是該技術帶來的一系列問題。NGS可以提供海量的數據量，但是其質量卻有待提高（有報道，NGS在序列拼接過程中，錯誤率在0.1-15%范圍內），并且NGS的序列讀長普遍較低（每條read的長度在35-700bp之內7，這比普通的Sanger測序要短），這意味著需要更嚴格復雜的序列拼接。盡管長讀長測序可以克服NGS的這一大弱點，但相對而言，成本較高并且通量較低，這也限制了該技術的進一步應用。最后，NGS同時還和其他的技術之間存在著競爭的關系。
短讀長（read）的NGS測序
測序模版克隆法生成綜述
短讀長測序方法包含兩種：邊連接邊測序（sequencing
by ligation, SBL）以及邊合成邊測序（sequencing by synthesis,
SBS）。在SBL方法中，帶有熒光基團的探針與DNA片段雜交并且與臨近的寡核糖核酸連接從而得以成像。人們通過熒光基團的發射波長來判斷堿基或者其互補堿基的序列。SBS方法通常使用聚合酶，而且，諸如熒光基團在鏈的延伸過程中被插入其中。絕大多數的SBL和SBS方法，DNA都是在一個固體的表面上被克隆。一個特定區域內成千上萬個拷貝的DNA分子可以增加信號和背景信號的區分度。大量的平行同樣對上百萬的reads的讀取大有幫助，每個平行只有唯一的DNA模板。一個測序平臺可以同時從上百萬的類似反應中讀取數據，因此可以同時對上百萬的DNA分子進行測序。
產生模板的克隆有幾個方法：基于磁珠（bead-based），固相介質（solid-state）以及DNA微球技術（DNA
nanoball）（圖1）。DNA模板產生的第一步就是樣本DNA的片段化，接著是連接到一個為了克隆和測序而設計的接頭上。在磁珠法的準備過程中，一個接頭和寡核糖核酸片段互補并且固定在珠子上（圖1a）。DNA模板通過使用油包水PCR（emulsion
PCR，emPCR）8得以擴增。單個珠子上被克隆得到的DNA片段可以達到上百萬個9。這些珠子可以被分為glass
surface10或者PicoTiterPlate（羅氏診斷）11。固相介質擴增12避免了油包水PCR，取而代之的是在固相介質上直接進行PCR13（圖1b,c）。該方法中，正向和反向引物結合在芯片的表面，這些引物給單鏈DNA（single-stranded
DNA，ssDNA）提供了末端的互補序列供其結合。最近，幾個NGS的平臺都是用了模塊化的flow cells。
BGI使用的Complete
Genomics
technology測序技術是唯一一個在溶液中完成模板富集的技術。在這種情況下，DNA被多次連接，成環以及剪切從而為了產生一個包含4個不同接頭的環狀的模板。通過旋轉環狀擴增（rolling
circle
amplification，RCA），可以最多產生超過200億的DNA微球（圖1d）。微球混合物隨后被分配到芯片表面上，使得每個微球可以占據芯片的一個位點14。
圖1:模板擴增策略。