高速冷凍離心機在核膜的亞分級分離中的應用

核被膜（nuclear envelope）是包被核內含物的雙層膜結構，作為界膜，它把細胞核與細胞質分開，有利于穩定基因的結構，外核膜與胞質中的粗面內質網相鄰，外表亦有核糖體附著，內核膜附著有一層纖維狀蛋白網，該結構對內膜具有支撐作用。核間隙與粗面內質網腔相通，內含多種蛋白質和酶，核膜還控制著細胞核與細胞質之間的物質交換。

分離核膜幾乎都以肝臟為原料，但不同類型的研究用不同的制備方法，有些方法適合于膜組成的研究，有些方法適合于酶與通透性研究。基本上分為低離子強度和高離子強度法。高離子濃度法用高濃度的陽離子使膜破裂，該方法能獲得較高產量的膜。低離子濃度法可使膜具有形態完整并保留的酶活性高。Kaufmann等用高離子強度介質快速從鼠肝細胞核中分離完整核膜，幾乎不受污染，對研究核基質和核被膜間的關系非常有用。Fraser等用DNase處理染色體分離核被膜碎片，染色體污染少。

本文講述用高速冷凍離心機進行核膜的亞分級分離的方法和步驟。

1.         把核被膜（大約1~2mg蛋白質）懸浮在5ml冰冷的10mmol/L三乙醇胺-HCl、0.1mmol/L蔗糖（pH=7.5）中，再加入0.5ml 20%（體積分數） Triton X-100，在0℃孵育10分鐘。

2.         該懸浮液，在45000g_max離心，使核被膜沉降。

3.         把沉淀重新懸浮在5mL相同的緩沖液里（不加去垢劑），再加入5ml 100mmol/L 三乙醇胺-HCl、2.0mol/L NaCl。

4.         在0℃孵育10分鐘后，懸浮液再發步驟2離心，沉淀是管孔復合體疊層膜。

在所有步驟中，勻漿重懸是基本步驟，在往沉淀里加2~3滴甘油搖動或手工勻漿。用1%（質量濃度）檸檬酸（1ml/mg核蛋白）抽提細胞核來制備外核膜，通過低速離心上清液在120000g_max離心（6*14ml甩開轉子，26500r/min）、4℃離心1小時來沉淀膜。

湖南湘立研制生產的幾款醫用離心機可以用來進行細胞分離，如DL5M/TDL5M兩種型號的低速冷凍離心機可用來進行干細胞實驗。XL03RH型控溫離心機（低速冷凍離心機）可用來進行溫度敏感型人體細胞分離。