實驗流程
1.稱取魚膠原蛋白粉樣品4g于平底燒瓶中,加入3mol/L硫酸溶液,用表面皿蓋住(沒有的用培養皿蓋上也一樣),放在105℃干燥箱內消解16h。
圖一
2.趁熱用圓形濾紙過濾到250ml容量瓶中,以10ml的3mol/L硫酸溶液分三次洗滌燒瓶和濾紙,合并于容量瓶中,以水定容。剛消解完的樣品(過濾前)大約是深棕色,如圖二:定容后會是淺黃色,如圖三所示。
圖二
圖三
3.移取一定體積水解液(本例取0.2ml)于250ml容量瓶中,以水定容,搖勻。
4.吸取4.00ml樣品溶液于25ml 比色管中,加入2ml氯胺T試劑,迅速混勻,放置20min。
5.再加入2ml顯色劑于比色管中,這時會出現如圖4所示乳白色的分層,這是正常現象,只要快速混勻,就會變成黃色的透明液體。然后用封口膜封住比色管。
圖四
6.將比色管迅速放入60℃水浴中,加熱20min中,取出后會變紅,空白是黃色的,如圖五所示:
圖五
7.迅速冷卻,與室溫放置30min,558nm處測定吸收值,這個方法的標準曲線,線性還是不錯的。
注意事項
1. 標準配置標準曲線取10.00ml,20.00ml,30.00ml,40.00ml標準儲備液到100ml容量瓶,實際工作中取1.00 ml,2.00 ml,3.00 ml,4.00 ml到10ml就可以了,這樣吸取和搖勻都方便。
2. 標準中水解液體積未明確給出,本例取0.2ml適用于羥脯氨酸含量8%-10%魚膠原蛋白粉。如果樣品實際含量不在此范圍,需要自己選擇合適體積,保證最終樣品溶液含有羥脯氨酸濃度在0.5-2.0μg/ml。
3. 氯胺T試劑應該是白色的,稱量時如果是黃色,說明試劑變質了。
4. 氯胺T試劑和顯色劑配好后,至于棕色瓶中,避光,臨用現配。