| 實驗方法原理 | 切出單一器官或組織,整個置于冷的胰蛋白酶中過夜,去除胰蛋白酶,短暫孵育器官或組織,于培養基中分散細胞,稀釋并接種培養物。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 受精卵 DBSS 粗制胰蛋白酶 |
| 試劑、試劑盒 | 培養基 皮氏平皿 |
| 儀器、耗材 | 鑷子 虹膜刀 移液器 試管 培養瓶 手術刀 |
| 實驗步驟 | 1. 如前所述(見方案 12.2 ) 取出胚胎(孵化10~13天的受精卵(>10天在英國需要許可證)),放入無菌的 BSS 中。 2. 除去頭部。 ![]() ![]() 3. 切除眼球,小心剖開后清除晶狀體、房水、玻璃體。 ![]() ![]() 4. 用兩把尖鑷子夾住視網膜,輕輕將色素層與神經層及結締組織分開 (10 天的胚胎需要用解剖鏡。用 0.25% 胰蛋白酶(0.25 粗制胰蛋白酶(Difco 1 : 250 或同等級別的產品),以 RPMI1640 或 S-MEM 配制,置于冰上。如果用純的胰蛋白酶,濃度可降低,如 Sigma 的“結晶級”或 Worthington 的“IV級”可配成 0.05%~0.1% 的濃度)及 1 mmol/L 的 EDTA 溶液短暫浸泡可促使兩組織易于分離)。將分離的組織放于一側。 ![]() 5. 用彎鑷子刺破顱頂,用勺取出腦,將腦、視網膜一起放于皿的一側。 ![]() 6. 從軀干的中間斷開(此處肝透過腹壁顯出粉紅色),若切在膈的位置則將從心臟和肝臟之間通過,但有時肝臟會出現在前半部而不是后半部。 ![]() 7. 輕輕探入切面的前半部,取出心臟和肺(挑出器官,確認后再切),把分離后的心臟和肺放于皿中的一側。 ![]() 8. 探入后半部,取出肝臟,由于腸夾于肝臟的兩葉之間可一并取出,分離肝和腸放于皿的一側。 ![]() 9. 折回體壁后半體腔背側面的內壁,可見長的分葉狀的腎并行排列于中線兩側。 10. 用刀尖輕輕地滑至腎的背面,使腎自軀體背面內側壁剝離(10 天的胚胎需要用解剖鏡),將腎分離下來后放于一側。 ![]() 11. 將兩把手術刀置于后部未端的中線上,尖端向前,交替前進像擠牙膏一樣將脊髄擠出。 ![]() 12. 將胚胎后部軀干翻轉,將皮膚自背部和腿上部撕脫,收集皮膚放于一側。 ![]() 13. 自每條腿的股部切下肌肉,收集到一起。 ![]() 14. 將所有這些收集的組織以及其他所蓋要的任何組織分別轉入含 1 ml 0.25% 胰蛋白酶的試管中,放于冰上,確認組織塊已沉入胰蛋白酶溶液中。 15. 于 4°C 放置 6~18 h 。 16. 小心吸去胰蛋白酶,不要攪動組織塊;振動或慢慢旋轉試管將有助于消化。 17. 組織塊在剩余的胰蛋白酶中 37°C 孵育 15~20 min。 18. 每種組織接種兩個 25 cm2 培養瓶,每個培養瓶加 4 ml 的培養基。 19. 向含組織和剩余胰蛋白酶的試管中加入 2 ml 培養基,輕輕上下吸打分散組織。 20. 讓大塊組織沉淀。 21. 將上清吸入第一個培養瓶中,混勻,將 1 ml 稀釋的懸液移入第 2 個培養瓶。這樣做使得兩瓶的細胞密度不同,可免去細胞計數,而試驗可確定細胞的適宜濃度,用于以后的實驗。 22. 按需要更換培養基(如腦于 24 h 后更換;視網膜色素層則大約保持 5~7 天),并檢測形態學特點和功能。 |
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