實驗方法原理 不要過度擴增黏粒文庫,因為這樣會不可避免地引起原基因組的失真。生長較快的克隆會過度呈現,不穩定的克隆會發生重排,而生長慢的克隆可能會從文庫中完全消失。
實驗材料 λ 噬菌體包裝反應大腸桿菌接種菌株
試劑、試劑盒 甘油
儀器、耗材 卡那霉素的瓊脂平板TB 培養基Sorvall GSA 轉頭或同類產品凍存管
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液與溶液
甘油
2. 培養基
含 25 μg/ml 卡那霉素的瓊脂平板
TB 培養基
含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培養基
3. 離心機與轉頭
Sorvall GSA 轉頭或同類產品
4. 專用設備
凍存管
5. 載體及菌株
λ 噬菌體包裝反應
適宜的大腸桿菌接種菌株(如 XLl-Blue、ED8767、NM554、DH5αMCR)
二、方法
預培養
1. 計算能產生 3 萬~ 5 萬個轉化菌落的包裝反應體積。
2. 取若干無菌試管,在每管中加入 0.2 ml 接種細菌,接著加入包裝反應液并使其達到步驟 1 確定的體積。
3. 將試管在 37℃ 溫育 20 min。
4. 各管中分別加入 0.5 ml TB, 繼續溫育 45 min。
在含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培養基中擴增
5. 分別取 0.25 ml 各種感染的細胞,接種于 100 ml 含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培養基 中,置于 250 ml 培養瓶。
6. 37℃ 劇烈振搖培養,使細胞密度至 OD600=0.5~1.0。
7. 合并所得培養物,5000 g ( 5500 r/min,Sorvall GSA 轉頭)4℃ 離心 10 min,回收細胞,再用 1/10 原體積的 TB 重懸細胞。
8. 向細胞懸液中加入無菌甘油至終濃度為 15% (V/V)。顛倒封好口的試管數次,充分混勻懸液。將細菌懸液以 0.5~1.0 ml 的體積分裝于數個無菌管,封好管口,-70℃ 保存。
9. 進行篩選時,于 37℃ 迅速融化一小份凍存細胞,按毎張膜 3 萬~ 5 萬個細菌的密度鋪到編好號碼的濾膜上。在影印濾膜上裂解菌落,然后將濾膜與標記探針雜交。