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  • 發布時間:2020-08-10 22:13 原文鏈接: 黏粒文庫的擴增和貯存(在液體培養基內擴增)

    實驗方法原理 不要過度擴增黏粒文庫,因為這樣會不可避免地引起原基因組的失真。生長較快的克隆會過度呈現,不穩定的克隆會發生重排,而生長慢的克隆可能會從文庫中完全消失。

    實驗材料 λ 噬菌體包裝反應大腸桿菌接種菌株

    試劑、試劑盒 甘油

    儀器、耗材 卡那霉素的瓊脂平板TB 培養基Sorvall GSA 轉頭或同類產品凍存管

    實驗步驟

    一、材料


    1. 緩沖液與溶液


    甘油


    2. 培養基


    含 25 μg/ml 卡那霉素的瓊脂平板


    TB 培養基


    含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培養基


    3. 離心機與轉頭


    Sorvall GSA 轉頭或同類產品


    4. 專用設備


    凍存管


    5. 載體及菌株


    λ 噬菌體包裝反應


    適宜的大腸桿菌接種菌株(如 XLl-Blue、ED8767、NM554、DH5αMCR)


    二、方法


    預培養


    1. 計算能產生 3 萬~ 5 萬個轉化菌落的包裝反應體積。


    2. 取若干無菌試管,在每管中加入 0.2 ml 接種細菌,接著加入包裝反應液并使其達到步驟 1 確定的體積。


    3. 將試管在 37℃ 溫育 20 min。


    4. 各管中分別加入 0.5 ml TB, 繼續溫育 45 min。


    在含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培養基中擴增


    5. 分別取 0.25 ml 各種感染的細胞,接種于 100 ml 含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培養基 中,置于 250 ml 培養瓶。


    6. 37℃ 劇烈振搖培養,使細胞密度至 OD600=0.5~1.0。


    7. 合并所得培養物,5000 g ( 5500 r/min,Sorvall GSA 轉頭)4℃ 離心 10 min,回收細胞,再用 1/10 原體積的 TB 重懸細胞。


    8. 向細胞懸液中加入無菌甘油至終濃度為 15% (V/V)。顛倒封好口的試管數次,充分混勻懸液。將細菌懸液以 0.5~1.0 ml 的體積分裝于數個無菌管,封好管口,-70℃ 保存。


    9. 進行篩選時,于 37℃ 迅速融化一小份凍存細胞,按毎張膜 3 萬~ 5 萬個細菌的密度鋪到編好號碼的濾膜上。在影印濾膜上裂解菌落,然后將濾膜與標記探針雜交。


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