CRISPR明星技術2015開年精彩不停

　　可以毫不夸張地說，CRISPR-Cas9已經風靡生物技術世界。

　　無論是在基礎研究，還是臨床研究方面，RNA引導性核酸酶使研究人員能夠以單核苷酸分辨率編輯活細胞的基因組，這為生物技術不少領域帶來了新希望。借助于CRISPR-Cas9基因編輯技術，科學家們能夠調查一些基因和遺傳突變在人類生物學及疾病中的作用。這一系統可以在DNA水平上消除基因的功能，相比之下像RNA干擾一類的遺傳干擾技術則是在RNA水平上發揮作用。

　　在2015年剛剛開年的這三個月里，CRISPR技術相關的成果如潮水一般的涌來，單從NCBI上的數據就可以看出，發表的論文已經達到了上萬個，從成果上來說，不但在衰老研究，癌癥研究方法取得了重要成果，而且技術上也突破了一個個難題。

　　首先，從技術本身來說，2014年在兩個方面得到了改進：提高導向RNA（gRNA）的特異性，以及如何篩選脫靶。對于第一個問題，Nature Biotechnology雜志建議切斷gRNAs，減少脫靶問題，而且不影響靶標活性，而另外一個研究組則建議更長一些的gRNAs。

　　第二個問題，研究人員認為可以用配對替換切口酶（nickases）替換Cas9 核酸酶（前者每次只能切斷DNA一條鏈），或者將 Cas9突變融合到Fok1 這種需要催化激活的核酸酶中去。此外，通過來自不同物種的Cas9也能增加靶向多個位點的靈活性，進一步改善 Cas9-gRNA 復合物的傳遞系統，也有助于增加效率。

　　2015年，來自美國希望之城貝克曼研究所等處的研究人員使用了一種基于整合酶缺陷型慢病毒載體（IDLV）的技術，通過表達CRISPR/Cas9核酸酶或TALENs的質粒轉染HEK細胞，之后轉導了IDLV。這個IDLV攜帶的基因賦予了抗生素和嘌呤霉素的抗性。核酸酶形成DSB后，允許IDLV整合，使得耐受嘌呤霉素的克隆數量增加了兩到三倍。

　　還有來自韓國首爾大學等處的研究人員開發出一種強大、敏感、無偏見和具有成本效益的方法——Digenome-seq，可在全基因組范圍內檢測人類細胞中的CRISPR/Cas9脫靶效應。

　　這種方法利用基因組測序查找CRISPR-Cas9可能突變產生的打靶和脫靶序列。他們用Cas9核酸酶在試管中消化人類基因組DNA，然后進行全基因組測序。這種體外消化可產生打靶和脫靶序列的獨特模式，可以通過計算確定。此外，個在sgRNA末端添加組成CRISPR-Cas9的鳥嘌呤核苷酸，研究人員成功地制備了這種高度發達的可編程核酸酶，在人類基因組中它沒有可測量的脫靶效應。

　　更加令人激動的是，幾個研究組開發出了基于CRISPR-Cas9的轉錄激活系統，可以用光進行控制，該系統包括一對融合蛋白：一個蛋白把滅活Cas9蛋白結合到一個稱為CIb1的蛋白，另外一個蛋白將一個轉錄激活結構域結合到隱花色素2（CRY2）。用藍光照亮表達這兩個蛋白質的細胞和引導性RNA，可使兩個蛋白質片段配對，將轉錄激活結構域拴在DNA上，并激活轉錄。本設計為以前這種構成性的合成轉錄因子引入了一種調控機制。

　　在疾病研究方面，斯坦福大學的科學家利用一種基因組編輯工具箱構建出了可在自然短壽的非洲青鳉魚（African turquoise killifish）中研究衰老的平臺。

　　而來自Keio大學的研究人員建立了源自正常腸道上皮的類器官，并用CRISPR系統向其中引入了多個突變。研究人員通過CRISPR系統引入了腫瘤抑制基因APC、SMAD4和TP53突變，以及癌基因KRAS和PIK3CA突變。他們發現，表達全部五種突變的類器官，不依賴干細胞巢的因子就能在體外生長，而且移植到小鼠腎包膜下會形成腫瘤。