13例輸血后TTV動態觀察

自1997年10月Nishizaw等^［1］發表第1篇關于TTV的論文以來，許多國家開展了TTV的研究，我國北京^［2］、深圳^［3］等地也做了大量工作，但對于TTV的致病性，特別是輸入TTV陽性血后臨床上改變的調查較少。為了進一步闡明TTV的致病性，筆者對13名輸入TTV感染血的患者進行了3個月動態觀察，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

 1999年1月，選擇產科2例，外科10例，內科1例，其中男性10名，女性3名，年齡31～77歲。輸血前后對以上患者進行肝功能和TTV DNA測定，對其中1例TTV DNA陽性者進行分子克隆和部分核苷酸序列分析。

1.2 標本收集

采用經滅菌處理一次性帶蓋試管，對輸血后患者空腹靜脈抽血10ml，離心分離血清，分裝后－20℃保存備用；輸完血后取輸血袋，血漿分裝后－20℃保存，并進行TTV DNA的測定，發現獻血陽性者，分期隨訪患者。

1.3 檢測材料

 HAV-IgM、HBVM、抗-HCV、HDVAg、HDVAb、抗-HEV免疫試劑購于廣州中山公司，抗-HGV酶聯免疫試劑由302醫院提供，肝功能檢測采用美國ASCATM全自動生化分析儀。ALT、AST、TP、Alb、TBiL、DBiL、γ-GT液體型生化試劑由上海復旦張江生物醫藥公司提供，套式PCR試劑盒由北京軍區總醫院提供。

1.4 引物合成

根據Okmato等報道TTV基因序列^［4］，采用Goldkey軟件在TTV ORF保守區設計兩對套式引物，引物序列如下：T1:5’-AC AG AC AG AG GA GA AG GC AA C-3’；T2：5’-G GA TA CC TA TT AG CT CT CA T-3’；T3：5’-AA CA TG TT GT GG AT AG AC TG G-3’；T4：5’-CC TG GC AT TT TA CC AT TT CCA 3’其中T1、T2為外引物，T3、T4為內引物，擴增產物長272bp。

 1.5 TTV DNA的檢測

 ①裂解：血清50μl，加裂解液150μl混勻，94℃10min。②分離：在裂解混合液內，每反應體系加入氯仿／異丙醇及飽合酚，震搖試管10s，混勻。在臺式離心機上10000r/min離心，室溫10min收集水相沉淀。③沉淀：異丙醇200μl，立即加已含DNA水相試管內，-20℃30～60min；離心：12000r/min離心，室溫15min，用微量真空泵吸取上清及管邊水珠。④第1次PCR：每反應體系加入第1次PCR反應混合液50μl懸浮沉淀，液體石蠟封頂，預變性94℃30s，94℃30s，55℃45s，72℃45s，35次循環，⑤取每反應體系，加第2次PCR反應混合液45μl，混勻分別取第1次PCR產物5μl，加入45μl反應混合液中，液體石蠟油封頂，預變性94℃30s，94℃30s，55℃45s，72℃45s，35次循環。⑥產物檢測：用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳或2%瓊脂電泳檢測，溴化乙錠染色，在紫外檢測儀上觀察結果，設陰、陽性對照。

 1.6 PCR產物的分子克隆與測序

取第2次PCR產物，經酚／氯仿抽取，乙醇沉淀純化后，直接于T載體連接，轉入XLT-Blus宿主菌，挑取白色菌落，用PCR鑒定，對陽性菌落接種培養，提取質粒，采用OPEN GENE型自動測序儀，進行DNA測序。

2 結果

2.1

13名患者接受的血液均為TTV DNA陽性 PCR產物電泳結果：分別對第1、2次PCR產物進行電泳，第1次未見陽性帶，第2次陽性標本可見272bp DNA帶，與預期大小一致(圖1)。 圖1 TTV DNA的PCR產物電泳圖

2.2

PCR產物的克隆及序列測定結果 對1例肝炎患者血清PCR產物克隆測序表明，其核苷酸序列與Okamoto等^［4］報道的日本株(AB 008394)N22克隆同源性為75.4%，與國內深圳株(SZ1、SZ2)比較，同源性為73.9%、75.7%，與日本株(NA004)比較，同源性為88.6%。本株與JX2株比較同源性為81.74%。見圖2。 圖2 江西TTV分離株(JX1-JX2)與日本株(AB008394), 深圳株(SZ1-SZ2）相應核苷酸序列比較

2.3

輸血前后檢查結果(附表) 所有患者輸血前的肝功能均正常，TTV DNA呈陰性，7例輸TTV DNA血后變為陽性，并有肝功能異常，其中1個月后變陽性3例，兩個月后變陽性2例，3個月后變陽性2例，陽性持續時間80d左右。

附表 輸血前后TTV感染檢測

本室的參考值：ALT：2～25U／L，γ-GT：8～30U／L 3 討論

盡管對獻血者及血液制品均進行乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的篩選，但輸血后肝炎仍有發生。1997年底，日本學者以1例輸血后的非甲～庚型肝炎患者血清中分離出一種新型病毒基因，命名為TT病毒(TTV)。為了探討有關TT病毒的特征、致病特點，在輸血后肝炎發病中的作用和地位，筆者對13名接受TTV DNA陽性血患者進行了動態觀察，6例未見明顯異常，7例ALT、γ-GT等酶學發生了改變，TTV DNA檢測為陽性，經過獻血者和感染者體內TTV基因序列測定，證明確屬輸血所致，說明輸入TTV陽性血，對患者能產生一定影響，應引起臨床上重視。

關于TTV基因變異研究資料尚少，Okamoto等^［4］根據TTV 1902-2257位核苷酸之間，356bp的序列，分析了日本78個分離株，認為78個分離株中76個可分成1組，另外兩個1組，共4個亞組，即G1a、G1b、G2a、G2b。萍鄉地區分離株與日本株(AB008394)同源性高，可能是同一病毒，不同的分離株，屬于G1亞型的一種，TTV基因變異及不同亞型是否與其致病性有關，有待進一步研究。

參考文獻

1，Nishizawa T,Okamoto H,Konishik,et al.A novel DNA Virus(TTV)assocoted transaminase levels in posttransfution hepatitis of unknow etiology.Biochem Biophys Res Commun,1997,241：92

2，周育森，周乙華，王海濤，等.中國部分地區新型肝炎病毒TTV感染的分子流行病學.中華預防醫學雜志，1998，32：352

3，周伯平，馬為民，孫 彤,等.一種新型肝炎病毒的分子克隆及核苷酸序列分析.深圳醫學，1998，11：1

4，Okamoto H,Nishizawa T,Kato N,et al.Molecular cloning and characterization of a novel DNA Virus acsocited with posttransfution hepatitis of anknow etiology.Hepatol Res,1998,10:1