16SRNA靶向變性梯度凝膠電泳指紋圖譜分析微生物菌群

疏水面的水將滑落)。

5.用滾筒固定膠貼后移去紙保護層。

6.用紙巾輕輕吸干膠貼。

7.用 9 6 % 乙醇清洗分隔條，并放于膠貼的左右兩側。

8.將小玻璃板放在上方。

9.用夾子夾住玻璃「三明治」，并 放 人 「三明治」支架。

10.按下襯墊，并擰緊壓板的螺絲。

11.將玻璃「三明治」放在橡膠密封墊上，并按下手柄。

12.用移液器加人凝膠「塞」。

3.4.2 凝 肢 「塞 」 制 備

在制備主要的分析梯度凝膠前，需 在 D G G E 玻璃板盒底部做一個〇 % 變性劑 P A G 凝 膠 「塞」 *— 防止底部泄露。制備凝 膠 「塞」的主要方法如下：

1.確保凝膠架處于水平；必要時調節底部的螺絲。

2.如下制 備 「塞」溶 液（一塊凝膠體積）：3.5 m L 〇 % 變性劑， 8 % P A G 溶液4.5 T E M E D15 p-L 1 〇 % (W /V ) 過 硫 酸 銨（A P S )

3.通過橡膠密封墊一邊加人 I m L 「塞」溶 液（見注釋 7)。

4.「塞」溶液放置 lOmin。

5.灌人梯度凝膠和濃縮膠。

3.4.3 制 備 凝 肢

1.從低到高濃度梯度凝膠和濃縮膠按表 2 混合配置，操作在冰上進行（見注釋 8)。

2.用軟化水清洗梯度制備儀和連接管道，打 開 泵（流 速 為 19 m L /min) , 抽干系統 。

3.關閉梯度制備儀各室之間的開關。

4.用紙巾吸干各室。

5.當凝膠溶液冷卻后，加 人 10% A P S 至高濃度和低濃度的變性劑溶液。

6.在右室加入高濃度溶液，在左室加入低濃度溶液。

7.開始攪拌，打開開關，并立即啟動泵保持流速 4. 5 m L /min。

8.將針頭放于兩塊玻璃板間。

9.當凝膠灌注結束后，關掉泵，轉移至 Erlenmeyer 燒瓶。

10.用軟化水清洗各室，啟動泵抽干系統。

11.加 10% A P S 到濃縮膠中。

12.關掉各室間的開關，在右室加人濃縮膠。

13.將針頭放于兩塊玻璃板間，啟動泵，保持流速為 3 m L /min。

14.灌完濃縮膠后，插人梳子，讓其凝固形成加樣孔。避免氣泡產生，否則會在條帶中出現凹陷。
3.4.4 電泳

1.在電泳槽中加人〇.5X T A E 緩沖液。

2.在電泳前至少 90m i n 打開 Dcode，以便緩沖液在 6 〇- c 達到平衡。

3.在 I h 的聚合后，輕輕拔出梳子。

4.用軟化水清洗孔內和孔上未聚合的凝膠，并 輕 敲 「三明治」。

5.關掉 Dcode，打開蓋子。

6.拿 出 「三明治」，放人電泳槽中。

7.打開 Dcode, 直至上緩沖室充滿緩沖液。

8.關掉 Dcode, 打開蓋子。

9.用充滿緩沖液的注射器和針頭清洗所有加樣孔。

10.在加樣孔中加入樣品（見注釋 10)。

11.蓋上蓋子，后打開 Dcode。

12.打開電源， 200 V 電泳 10 m i n 后，調至 85 V 再電泳 16 h。

3.5 凝 膠 染 色（見 注 釋 1 1 和 12)

1.關閉電源。

2.從板上移出凝膠，放人不銹鋼托盤中。

3.加入 200 m L lXCairns』固定液，搖 晃 3 min。倒出并回收利用。

4.向托盤中加入 200 m L 銀 染 溶 液（注意戴手套），搖 晃 10 min。

5.棄 掉 溶 液（見注釋 13)。

6.用軟化水清洗托盤。

7.加人新鮮的軟化水并振蕩 2 min。

8.棄掉廢水。

9.用軟化水清洗凝膠和膠貼。

10.將凝膠放人用于盛顯影液的不銹鋼托盤。

11.加入少量的顯影液并輕輕搖晃，棄除此部分顯影液，后加入剩下的顯影液。

12.搖晃至凝膠染色完全。

13.棄除顯影液。

14 加入前面使用的 200 m L l X C a i r n s 』固定液至盒中，振 蕩 5 min。

15.棄除固定液。

16.加人少許的軟化水并振蕩 2m i n。

17.用 C aims，保存液換掉軟化水，振 蕩 7 min。

18.膠放在玻璃板上（膠貼面朝下）。

1 9.在保存液中將大小合適的玻璃紙預濕，放在凝膠之上（見注釋 14) 。

20.60°C 干燥凝膠過夜。

為了說明此方法用于復雜微生物群落在不同分類水平上具有的鑒定和比較價值，圖2 和圖 3 列舉了在新鮮和風干的土壤中總的細菌和 BadZZzw 6enzoeworaws 相關群落的D G G E 圖譜。