2009年最值得關注的技術：PCR

　　摘要： 澳大利亞阿德萊德大學的研究發明出一種溫度轉變PCR(temperature-switch PCR)，在單個反應管中發生兩次擴增，實現了基于PCR的SNP基因分型1。這種技術減少了優化單個反應的需要。

　　PCR技術自誕生以來，20多年始終重復著變性、復性、延伸三步曲，雖說PCR酶的改進不少，但主旋律始終不變。直到今年，PCR有了一些技術上的進步，也值得我們關注。

　　最近，澳大利亞阿德萊德大學的研究發明出一種溫度轉變PCR(temperature-switch PCR)，在單個反應管中發生兩次擴增，實現了基于PCR的SNP基因分型[1]。這種技術減少了優化單個反應的需要。

　　溫度轉變PCR使用兩組精確設計的引物：在第一階段一對位點特異的引物富集靶序列，接著在第二階段，一對巢式引物只擴增包含待分析等位基因的DNA。兩組引物對的退火溫度存在很大差異，從而實現了在反應不同階段的結合。

　　對于SNP分析而言，溫度轉變PCR具有很好的靈敏度和特異性。它能夠擴增60-500 bp的等位基因，之后用電泳或高分辨率的熔解曲線分析來檢測。這種分析對不同濃度和質量的DNA都奏效，起始濃度低于100 ng則更佳。研究人員通過盲法試驗，說明了溫度轉變PCR具有高的基因分型準確性。

　　另一方面，在目前盛行的新一代測序中，擴增大量目的序列是必要的一環。加利福尼亞大學Kelly A. Frazer教授領導的研究小組發現以微滴(microdroplet)PCR為基礎的序列富集比傳統PCR更有效[2]。

　　在《Nature BioTechnology》發表的文章中，他們認為微滴PCR極其高效，能高度重復地擴增樣品中的目的序列。利用RDT 1000序列富集儀器(RainDance Technologies)，研究人員產生的等位基因偏移誤差率在0.1%。

　　Frazer認為：“與其它類型的序列富集相比，我們能夠更均一地覆蓋目的序列。此外，普通PCR常常遇到的問題，如引物設計困難和高的等位基因偏移，在微滴PCR中觀察不到。”

　　研究人員認為微滴PCR顯示出目的序列與背景序列的比例較高，即使是同時擴增3900多個目的序列。而這些優勢將轉化成更高的測序效率，讓群體研究更為經濟。

　　參考文獻：

　　[1] Tabone T. et al. Temperature Switch PCR (TSP): Robust assay design for reliable amplification and genotyping of SNPs. BMC Genomics 10:580 (2009)

　　[2] Tewhey R. et al. Microdroplet-based PCR enrichment for large-scale targeted sequencing. Nature Biotechnology 27, 1025 - 1031 (2009)