2017單細胞擴增測序技術的最新進展

　　細胞是構成生命體的結構和功能的基本單位，不同類型的細胞形態迥異，功能也各不相同。即使是同類細胞間看似相同，相互間也存在著廣泛的細胞異質性。傳統的群體細胞分析檢測能更快速方便的獲得大量數據并利于進行有效的統計學分析，但是隨著研究的深入，這種基于群體細胞分析所獲得的平均性數據，往往忽略了細胞個體間的差異，在很大程度上掩蓋了不少稀有、微量樣本的作用以及在生命體內廣泛存在的隨機行為，這些“平均”結果帶來的數據缺失，甚至是與事實相反的錯誤結果，都是基于群體分析無法避免的結果。而針對單細胞水平的細胞異質性研究，則在很大程度上彌補了這一缺陷，也逐漸成為近年來科學家們關注的重點。下面我們來盤點一下2017單細胞擴增測序技術的最新進展。

　　· Science報道新型單細胞全基因組線性擴增技術有助避免遺傳病——LIANTI

　　謝曉亮院士在4月14日的Science上發表文章報道其最新研究成果：一種新型的單細胞基因組線性擴增的方法—LIANTI（Linear Amplification with Transposon Insertion）。自2012年謝院士團隊發明MALBAC?技術以來，單細胞擴增測序已被廣泛應用于生殖遺傳，癌癥腫瘤，生命科學等研究中。新的LIANTI法基于轉座子插入的線性擴增方法，跟以前的MALBAC，DOP-PCR，MDA等技術相比，在擴增基因覆蓋率，保真性等所有指標上都有大幅度提高，讓單細胞擴增與測序更加精準，為生命科學和轉化醫學的研究提供了更有力的保障。

　　LIANTI法通過轉座子插入進行線性放大。基因組被含有T7啟動子的Tn5轉座子隨機片段化(400bp左右)，T7啟動子允許線性擴增。LIANTI法優于現有的方法，測量拷貝數的空間分辨率提高了３個數量級（能在千堿基分辨率進行微CNV檢測，基因組覆蓋率可達到97%)，由此能查出基因組上以前查不出來的一些小段堿基微缺失，直接觀察從細胞到細胞不同的，隨機發生的DNA復制起始。這意味著LIANTI法能更有效、更精準地檢測出更多遺傳疾病。

　　· 高通量單細胞組合標記測序技術力助癌癥異質性研究——SCI-seq

　　美國俄勒岡健康與科學大學的研究人員研發出了一種稱為SCI-seq（單細胞組合標記測序技術），多次對細胞進行條形碼編碼標記后對它們進行測序的方法。這種方法極大地擴大了能夠繪制基因組圖譜的單細胞數量。可以同時構建上千個單細胞文庫，檢測體細胞拷貝數的變異。這項技術極大的縮減了文庫構建的成本，增加了檢測細胞的數量，這對于體細胞變異的檢測，尤其是在腫瘤進化過程中對細胞亞克隆變異研究具有重要價值。研究人員在靈長類額葉皮層組織和兩個人類胰腺癌中構建了16，698個單細胞基因組文庫，這大約比利用常規方法能夠構建出的基因組文庫大小高出兩個數量級。如果我們能了解腫瘤不同細胞組分的詳細情況，就能夠更加精準地靶向這種癌癥”。

　　· 單細胞空間轉錄組測序新技術——Geo-seq

　　中科院生物化學與細胞生物學研究所細胞生物學國家重點實驗室的景乃禾團隊通過整合與優化單細胞測序和激光顯微切割技術建立了一種可以獲得具有空間位置信息的少量細胞轉錄組圖譜的技術方法：Geo-seq，這種方法不僅能解析少量細胞轉錄組信息，而且還能保留細胞原有位置信息，從而獲得單細胞空間轉錄組特征、轉錄因子和信號通路調控網絡。這是一種高效、高分辨率的空間轉錄組分析方案。

　　應用：

　　? 可用于轉錄圖譜的三維重建；

　　? 用于研究具有特殊結構的少量組織或細胞的轉錄組信息；

　　? 可以將外源的多能干細胞或者胚胎組織細胞“投遞”到體內胚胎的特定位，從而將未知來源的干細胞定位于體內胚胎的相應部位。

　　? 已成功應用于小鼠大腦發育、肝臟腫瘤學以及人的精子發育等研究中。

　　· 10X Genomics助力數字化單細胞轉錄組測序分析技術

　　10X Genomics和Fred Hutch的團隊利用基于液滴的方法，讓單細胞轉錄組學得以加速。他們使用了一種微流體平臺，基于GemCode技術，將帶有條形碼、索引分子、引物及其他的凝膠珠與單細胞混合。每個液滴內開展逆轉錄反應，以產生測序所用的帶有條形碼的cDNA。這種細胞封裝大約有50%的捕獲效率，可在6分鐘內發生。它能夠分析來自29個不同樣品的250，000個單細胞，并根據SNV來區分單個細胞。這項新的單細胞RNA測序方法，可實現數千個免疫細胞的分析。

　　· CRISPR液滴法單細胞RNA測序技術——CROP-seq

　　奧地利科學院CeMM分子醫學研究中心的Christoph Bock及其團隊通過創造性地將兩種極有前景的基因組學領域結合在一起，發明了這種被稱作CROP-seq的單細胞測序方法（CRISPR droplet sequencing，CRISPR液滴測序），能夠在利用其它方法很難實現的規模和細節上高通量地分析基因調控，有效的彌補了傳統單細胞測序由于細胞篩選導致的不足。

　　Bock團隊首先結合了CRISPR集中篩選和按序篩選的優勢，將CRISPR基因組編輯與單細胞RNA測序整合在一起，可實現同時研究上千個細胞的基因調控影響。隨后Paul Datlinger構建出一種病毒載體，能夠讓CRISPR gRNA在單細胞測序實驗中可視化觀察，再結合最新的用于單細胞RNA測序的液滴方法足以高通量地分析單個細胞中上千種基因組編輯事件的影響。

　　這種方法能夠產生首批人類基因組上2.3萬個基因中每個基因的調節影響的綜合圖譜。屬于CROP-seq的所有數據、操作流程、試劑和軟件將會免費地分享給大眾，從而能夠讓其他的科學家們在他們的研究中使用和推廣這種方法。

　　· 單細胞基因組突變檢測技術——SCMDA

　　愛因斯坦醫學院的Jan Vijg博士宣布開發并驗證了一種能夠準確鑒定單細胞基因組基因突變（單核苷酸變異分析）的新方法：單細胞多重置換擴增（SCMDA）和單細胞變異“訪客”技術——可以修復基因擴增過程中發生的核苷酸序列錯誤的技術。通過比較發現這種方法比目前市場上用于基因組分析的技術效果更好。

　　“能夠鑒定人體單細胞基因突變很重要，因為這可以在癌癥早期告訴我們患癌的風險。”Vijg博士說，史上首次，我們的基因組分析方法允許我們精確的評估她們患乳腺癌的風險。我們能夠對幾個單細胞進行測序，以檢測這些細胞中有多少基因突變，以及這些基因突變是否遠高于不患癌癥的病人的細胞中的基因突變。”除了可以評估人體患癌風險，這種可以鑒定單細胞基因突變的新方法還可以幫助揭示基因突變在人體衰老中的作用。

　　· 單細胞多組學平行測序

　　理解一個器官的發育和功能需要對組成該器官的所有細胞類型的特性有一個清晰的認識。傳統發現和分離細胞亞群的方法是基于幾個已知的標記基因表達出來的信使RNA或蛋白質實現的。但是對于一些罕見的細胞類型來說，鑒定出它們特定的標記基因目前仍存在很大挑戰。而發現一些罕見的細胞類型，如干細胞，短暫存在的前體細胞，癌癥干細胞或循環腫瘤細胞，對于深入理解正常和疾病狀態下的組織生物學具有非常重要的意義。這項研究通過開發一種算法分析轉錄組測序結果，能夠在復雜的單細胞群體中發現一些罕見的細胞類型及其特定標記基因，對于了解正常的和疾病狀態下的組織生物學具有重要意義。

　　· One-Cell-One-Tube的單細胞分離測序技術——FOCOT

　　中國科學院青島生物能源與過程研究所單細胞研究中心研究員馬波帶領的微流控系統團隊通過設計簡易高效的單細胞分選與測序對接裝置，發明了每個試管有且只有一個細胞(One-Cell-One-Tube)的FOCOT技術，有望服務于"現場"、"實時"乃至"便攜式"的單細胞分選與測序。該方法能夠精確、高速、低成本地分離、獲取與分裝單個微生物細胞，從而與單細胞測序直接對接。該方法具體為：首先，通過微流控技術，將細胞分散包裹在數十微米直徑的油包水微液滴中；然后，基于液滴顯微光學成像識別技術，分選出單細胞包裹液滴；最后，將單細胞包裹液滴順序分布于一系列試管中，從而快速實現單個細胞的分離，以及每個試管有且只有一個細胞，以實現與單細胞全基因組擴增與測序的直接對接。

　　還想了解最新的單細胞研究方法和應用嗎？敬請期待~