利用 SDS 裂解細胞 ，并用酸性苯酚分級提取細胞總 RNA, 這是一種適合于處理 mRNA 含量相對較低、內源性 RNase 活性較髙的細胞的方法，該方法 RNA 損失極少，簡便易行 ，可同時處理多個樣品。對大多數細胞株來說，在一個直徑 90mm 培養皿中培養細胞 ，其 RNA 收率為 100?200ug。
| 試劑、試劑盒 | 尤鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液EDTASDS乙酸鈉水平衡的苯酚 乙醇Tris-ClNaCL |
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| 實驗步驟 | 一 材料與設備
1)尤鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液 (PBS)
2)10 mmol/L EDTA (pH8.0 )
3)0.5% SDS
4)0. l mol/L 乙酸鈉（pH 5.2 )
5)水平衡的苯酚
6)乙醇
7)l mol/L Tris-Cl (pH8.0 )
8)5 mol/L NaCL
二 操作方法
1 ) 吸出培養液，用 7m l 冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液 ( PBS) 沖洗細胞培養皿內的單層細胞，重 復1 次.操 作 時 ，應將平板置于冰上，直至所有單層細胞沖洗完畢。
2 ) 每個直徑 90mm 培 養皿中加 2ml 10mmol/L EDTA(pH8.0 ) 、0. 5% SDS，用刮棒將裂解物刮入一次性使用的 15m l 離心管中。
3 ) 用 2ml 0. 1mol/L 乙酸鈉 （pH5. 2 )、10mmol./L EDTA( PH8. 0 ) 沖洗平板，并將沖洗液移至上述裝有細胞裂解物的離心管屮。
4 ) 將 4m l 水平衡的苯酚，于室溫振蕩 2mm，使之與細胞裂解物混勻，則細胞 DNA 形成白色絲狀沉淀。
5 )于 4 ℃ 以 5000r/ mm 離心 10mm 分相 ，兩相之間可見致密的 DNA 層 。
6 ) 用一支巴斯德吸管將上層 (水相）移至另一個 裝 有 440u1 冰 預 冷 的 lmol/L Tris-Cl( pH8. 0) 和 180ul 5mol/L NaCl 的離心管中。
7 ) 加 2 倍體積冰預冷的乙醇，混勻 ，于 0°C放置至少 30min
8 ) 于 4°C 以 5000r/mim 離 心 l0min 以沉淀 RNA，棄去乙 醇 ，離心管直立倒置直至所有乙醇揮發殆盡。
9 ) 用 200ul 冰預冷的 TE（pH8. 0 )重溶 RNA, 將其移至一個滅菌的微量離心管內，并加5mol/L NaCl、50ul 冰預冷的乙醇，
1 0 ) 用微量離心機于 4°C 以 12000 足離心 5min 以收集 RNA,
11)吸出所有的乙 醇 ，將打開管蓋的離心管置于實驗臺上放幾分鐘，讓最后殘留的痕量乙醇揮發殆盡。
1 2 )用所需緩沖液重溶 RNA。 |
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