| 實驗步驟 | 一 材料與設備
1)0.lmol/LNaOH
2)70%(V/V) 乙醇
3)3mol/L 乙酸鈉，PH5.2
4) 苯酚
5) 無 SDS 的結合緩沖液：5 mmol/LEDTA，10 mmol/LTris-HCl（PH7.5)0.4mol/LNaCl
6) 含 SDS 的結合緩沖液：0,5%(m/V)SDS,5 mmol/LEDTA，10 mmol/LTris-HCl(pH7.5)，0.4mol/LNaCI。
7)TE 緩沖液 1Ommol/LTris-HCl(pH8.0)，1 mmol/LEDTA.
8)SEVAG: 氯仿：異戊醇 (24:1)
9) 漂白劑（Bleach):50%(V/V) 家用漂白劑（HouseholdBleach)
10) 含 MgCl2 的 PBS(pH7.2):2.7 mmol/LKCl,4.3 mmol/LNa2 HPO4,，1.8 mmol/LKH2PO4,137 mmol/LMaCl 每升溶液加 lgMgCl2
11) 果蠅勻漿緩沖液：1%(m/L)SDS，0.15mol/L 乙酸鈉，高壓滅菌并冷卻到室溫后加入 PH8.0 的 Tris-HCl 和 EDTA 至終濃度分別為 50 mmol/L，和 5 mmol/L
二 操作方法
1. 準備果蠅胚胎
(二）操作方法
1) 收集胚胎，用雙蒸水漂洗。
2) 在 50% 漂白劑中去膜，然后用雙蒸水漂洗。
3) 把去膜的胚胎放在液氮中速凍。
4) 樣品可用于提取 RNAt&可以凍存于-60℃
5) 融化前將胚胎轉移到 50 ml 的管中.
2. 總 RNA 的分離
1) 在 10 ml 酚和 10 ml 果蠅勻漿緩沖液中勻漿 30s, 以平衡 polytron 勻漿器（以第七檔）勻漿。
2) 加入約 3 倍體積的果蠅勻漿緩沖液（如：.5 ml 胚胎加 5 ml 緩沖液）及 3 倍體積的酚至凍存的胚胎中。
3）用 polytron 勻漿器以 4.5 擋勻漿 3 次，每次 30s. 勻漿液在液氮中速凍幾秒至呈半固體。
4) 用 8OOml 雙蒸水洗滌勻漿器 2?3 次。
5) 加等體積的 SEVAG 至勻漿混合液中，振搖混合。
6) 室溫以 5000 g 離心 15 min，分層
7) 觀察離心的溶液.①如果水相非常少而中間層起泡沫，則用寬吸口的吸頭把中間層轉移到 50 ml 的管中，加入 1.5 倍體積的SEVAG，振搖混合后以 12000 g 離心 10 min. 保存水相繼續下面的操作。②如果中間層只有很少泡沫或沒有泡沫，則把水相轉移到 1.5 倍體積的 SEVAG 中，振搖混合，以 5000 g 離心 lOmin。保存水相繼續下面的操作。
8) 繼續用 SEVAG 柚提，至中間層沒有泡沫。
9）在水相中，加入等體積的酚/SEVAG(1:1)，按第 7) 步的方法抽提
10) 繼續以酚/SEVAG 抽提，直至看不見屮間層。
11) 用 SEVAG 抽提水相一兩次，保存水相。
12) 水相中加入 0.1 體積的 3mol/L 乙酸鈉和 2.5 體積的無水乙醇。
13) 顛倒混合，-80℃ 沉淀過夜。
14) 于 4°C，以 14000 g 離心 15 min
15) 去上清，室溫干燥約 2 min
16) 以適當體積的水溶解 RNA 沉淀 u 如果用下向的方法制 Poly(A)+RNA, 用含 SDS 的結合緩沖液溶解。
3. 從總 RNA 中分離 poly(A)+RNA
1) 按產品說明書水合 3 型 oligo(dT) 纖維素。
2) 用大量含 SDS 的結合緩沖液清冼纖維素。
3) 按下列順序漂洗柱子：10 倍體積的 0.lmol/LNa()H，10 倍體積含 SDS 的結合緩沖液 A 倍體積的 TE 緩沖液，10 倍體積含 SDS 的結合拳沖液
4) 保存 20ul 總 RNA(溶于含 SDS 的結合緩沖液中）于冰上，將剩余的總 RNA 上樣到 3 型 digo(dT) 纖維素柱上。
5) 收集洗脫液并 fl 過柱兩次以上。
6）冼脫液于-80℃ 保存。
7) 用 10 倍柱體積不含 SDS 的結合緩沖液洗柱
8) 用 6 倍柱體積 TE 緩沖液洗脫 poly(A)ˉRNA，在冰上收集洗脫液。
9) 洗脫液中加 0.1 倍體積乙酸鈉和 2.5 倍體積無水乙醇。
10) 樣品于 80℃ 過夜。
11) 于 4℃，以 14000 g 離心 10 min, 去上清。
12) 加入與上清等體積的 70% 乙醇漂洗沉淀。
13) 于 4℃. 以 14000 g 離心 10 min，棄上清。
14) 用重蒸水溶解沉淀. 分裝成適當體積于-80℃ 或 20℃ 保存
收起 |
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