24孔板下室一般加入600μl含20S的培養基。取細胞懸液100μl加入Transwell小室。
特別注意的是,下層培養液和小室間常會有氣泡產生,一旦產生氣泡,下層培養液的趨化作用就減弱甚至消失了,在種板的時候要特別留心,一旦出現氣泡,要將小室提起,去除氣泡,再將小室放進培養板。
培養細胞:
常規培養12-48h(主要依癌細胞侵襲能力而定)。24h較常見,時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外,處理因素對細胞數目的影響也不可忽視。
結果統計:
直接計數法,“貼壁”細胞計數,這里所謂的“貼壁”是指細胞穿過膜后,可以附著在膜的下室側而不會掉到下室里面去,通過給細胞染色,可在鏡下計數細胞。
取出Transwell小室,棄去孔中培養液,用無鈣的PBS洗2遍,甲醇固定30分鐘,將小室適當風干。
0.1%結晶紫染色20 min,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞,用PBS洗3遍。
400倍顯微鏡下隨即五個視野觀察細胞,記數。