| 實驗步驟 | 一 材料與設備
1)10 ml 細菌培養物，
2)DEPC 處理的水。
3) 裂解緩沖液：30 mmol/LTris-Cl(PH7.4)，100 mmol/LNaCl，5 mmol/LEDTA，1%(M/V)SDS, 使用前加蛋白酶 K 至 100ug/ml
4) 酚：氯仿：異戊醇 (25:24:1), 酚用 Tris-Cl(pH8.0) 平衡
5)24:1 氯仿：異戊醇
6)5mol/LNaCl。
7) 冰冷的無水乙醇和 70% 乙醇。
8)DNA 酶消化緩沖液：20 mmol/LTris-Cl(pH8.0),10 mmol/LMgCI2，2.5 mg/ml無 RNA 酶的 DNA 酶
9)TE 緩沖液 (PH8.0)。
10) 離心機。
11) 帶微探頭的超聲儀，
二 操作方法
1) 于 4℃12000 g 離心，從 10 ml 細闡培養物中回收細胞，重懸菌體于 0.5 ml 裂解緩沖液，并移入微量離心管中，在干冰屮凍結
2) 解凍并用微探頭超聲儀以 30W 超聲 3 次，每次 l0S，避免起泡，37℃ 溫育 6Omin。
3) 加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1) 抽提，于室溫用微量離心機高速離心 3 min，上層水相移入另一干凈微量離心管中。
4) 用酚：氯仿：異戊醇（25：24:1) 再抽提 1 次，再用氯仿：異戊醇（24:1) 抽提 1次。
5)400ul 水相加入 15ul 5mol/LNaCl，并加滿冰冷的無水乙醇，混勻并于冰上放置 15?30 min 或于-20℃ 過夜
6）于 4℃ 用微量離心機離心 15 min 沉淀用冰冷的 70% 乙醇沖洗，晾干，用 95ul DMA 酶消化緩沖液溶解沉淀，加 4ul 2.5 mg/ml 無 RNA 酶的 DNA 酶 I，37℃ 溫育60 min
7) 用酚：氯仿：異戊醇 (25:24:1) 抽提 1 次，移出水相，有機相加入 100ulTE 沖液，混勻，于室溫下用微暈離心機高速離心5min，合并兩次的水相。
8) 用氯仿：異戊醇（24:1) 抽提 1 次，加入 10ul 5mol/L NaCl 和 60ul 無水乙醇，在20°C 過夜或置于干冰/乙醇中 15 min 用微量離心機于 4℃ 下高速離心 15?30 min
9) 用 500ul70% 乙醇洗滌沉淀，晾干。溶解于 100ulDEPC 處理過的水。取 10UL 稀釋于 lml 水. 測 A260 和 A280 以定量 RNA, 保存于-70℃ 或以乙醇沉淀的形式保存。 |
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