2.9從聚丙烯酰胺凝膠中回收RNA片段

溴化乙錠洗脫緩沖液儲存液8mol LLiCl 溶液異丙醇70% 乙醇1XTBE 緩沖液

聚丙烯酰胺凝膠電泳槽金屬小鏟Whatman3 MM 濾紙玻璃棒表面皿保鮮膜透射紫外燈刀片Texta 筆射線膠片

一材料與設備

1) 溴化乙錠：10 mg/ml 的水溶液

2) 洗脫緩沖液：80% 的甲酰胺溶于 40 mmol/LPIPES，lmmol/LEDTA 和 400 mmol/LNaCl(如要回收 35S-標記的 RNA，需含 l0 mmol/LDTT)

3) 儲存液：1Ommol/LDTT 的無菌水溶液

4)8mol/LLiCl 溶液

5) 異丙醇

6)70% 乙醇

7)1XTBE 緩沖液

8) 聚丙烯酰胺凝膠電泳槽

9) 金屬小鏟

10)Whatman3 MM 濾紙

11) 玻璃棒

12) 表面皿

13) 保鮮膜

14) 透射紫外燈

15) 刀片

16)Texta 筆

17）射線膠片。


二操作方法

(一）準備工作

對 RNA 樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。

(二）回收目的 RNA 片段

1. 非放射性標記 RNA 片段回收

1) 將凝膠板從電泳槽中取出，并將之平放桌上。假如只有前板被硅化了，那么在分離兩板前將凹面的后板面朝上放置。分離兩板后，凝膠應仍粘在前板上，在兩板間插入一金屬小鏟，小心撬開兩板。若凝膠粘在 G 板上，則將平板翻轉過來，再試一次。總之，凝膠最終應仍粘在其中的一塊玻璃板上，作為支持。

2) 兩塊玻璃板被分開后，將凝膠置于一塊 Whatman3 MM 濾紙上。將玻璃板水平放置，凝膠朝上，然后將一張事先濕潤的比凝膠大 2?3 cm 的 Whatman 濾紙放在凝膠表面, 用玻璃棒在濾紙的表面輕輕滾動，以除去氣泡和皺褶并使濾紙平整的粘在凝膠去除濾紙的一角. 然后將兩者從玻璃板上取下來。應一次取出紙和凝膠，操作時應注意動作要輕。然耵將兩者浸入一較淺的表面皿中，皿中盛有溶于 1XTBE 的 0.5 mg/ml 溴化乙錠，染色 15?45 min 后，取出凝膠和濾紙

3) 放置一片質量較好的保鮮膜于透射紫外燈的表面，將有凝膠的一面置于其表面，輕輕剝去 Whatman 濾紙后. 可用透射紫外光觀察凝膠。

4) 確定目的 RNA 條帶，然后從保鮮膜上切下目的帶，置于離心管中。

5）用吸頭擠壓凝膠塊，壓碎凝膠。在其上覆蓋 1?2 倍體積的洗脫緩沖液，可加至 0.5 ml,37℃ 孵育，同時不斷輕輕振蕩，以有利于 RNA 的洗脫。3?4 h 之內小于 500bp 的片段將被洗脫下來. 更大的片段可能需要大約一天的時間才能被洗脫下來。

6) 離心，回收上清液，再用 0.5 體積的洗脫緩沖液漂洗凝膠，離心，回收上清液 ?合并上清液。

7) 用一倍體積的異內醇沉淀 RNA，離心回收由于小片段的 RNA 回收是十分完全的，故此處無需添加 RNA 載體

8) 用 70% 的乙醇洗 RNA 沉淀，然后用 10 mmol/L 的 DTT(如有可能最好加入 RNA 酶抑制劑）重懸 RNA。加入 0.1 體積8mol/LLiCl 和等體積的異丙醇重新沉淀 RNA

9) 離心冋收 RNA,70% 的乙醇洗滌 RNA 沉淀。

10) 將 RNA 樣品溶于 10 mmol/LDTT 中，一 70℃ 保存。

1 放射性標記 RNA 片段回收

1) 同前述的方法撬開兩板，然后在凝膠表面覆蓋一層保鮮膜。

2）用 Texta 筆在保鮮膜上標記好凝膠的左右兩邊界。在暗室中將 X 射線膠片進行曝光，凝晈要恰好放置于 X 射線膠片的上層。在黑暗中曝光 1?2 min 后，顯影。此時，相比于膠片上的凝膠背景，保鮮膜上所作的標記將呈現半透明的狀態，面成功標記的 RNA 將呈現較濃的黑色的條帶。

3) 通過保鮮膜上的標記以及膠片上的標記可勾勒出凝膠的輪廓并確定 RNA 條帶的位置。透過保鮮膜切下相成的凝膠條帶，然后同前述的方法回收 RNA 片段。

1)Whatman 3MM 濾紙貼放到凝膠表面時，注意防止氣泡和皺褶的產生。

2)在橾作放射性標記的片段時.應注意防護，以防止放射性損傷