3.5RNA反轉錄

poly(A)+RNA反轉錄酶鼠源反轉酶 或禽源反轉錄酶

oligo(dT)12-18lmol LTris-Cl1mol LTris-Cllmol LKC125 mmol LMgCl2dNTP 混合物0.lmol LDTTRNasin

一材料與設備

1)poly(A)⁺RNA,lmg/ml

Z)oligo(dT)_12-18,lmg/ml

3)lmol/LTris-Cl（pH7.6)。

4)1mol/LTris-Cl(pH8.3)

5)lmol/LKC1

6)25 mmol/LMgCl₂

7)dNTP 混合物，各 5 mmol/L

8)0.lmol/LDTT

9)RNasin。

10) 反轉錄酶，鼠源反轉酶 (Pharmacia 公司，200U/ul) 或禽源反轉錄酶（20U/ul)


二、操作方法

(一) 使用鼠源反轉錄酶合成 cDNA

1) 在滅菌微量離心管中混合下列物質，并置于冰上:

Poly(A)⁺4RNA,lmg/ml                                          10ul

oligo(dT)_12-18,lmg/ml                                          10ul

lmol/LTris-Cl(pH7.6)                                             2.5ul

lmol/LKC1                                                          3.5ul

250 mmol/LMgCl₂                                                2ul

dNTP 混合物，各 5 mmol/L                                 10ul

0.lmol/LDTT                                                        2ul

RNasin                                                             25U

鼠源反轉錄酶                                                    200U

加水至總體積為                                                 50ul

2) 于 37°C 反應 lh

3) 純化回收. 保存于一 20℃

(二）使用禽源反轉錄酶合成 cDNA

1) 在火菌微量離心管中混合下列物質，井置于冰上:

poly(A)⁺RNA,lmg/ml                                             10ul

oligo(dT)12-18,lmg/ml                                           10u1

lmol/LTris-Cl(pH8.3)                                              2.5uI

lmol/LKC1                                                            3.5ul

250 mmol/LMgCI2                                                 2ul

dNTP 混合物，各 3 mmol/L                                   10ul

0.lmol/LDTT                                                          2ul

RNasin                                                                25U

禽源反轉斌酶                                                       40U

加水至總體積為                                                    50ul

2) 于 42℃ 反應 lh

3) 純化冋收，保存于一 20℃

1) 可以先進行小規模的預實驗以確定反轉錄酶的用量。

2) 在反應中加入 [α³²P]dCTP，可以通過放射性自顯影檢測反轉錄的質量和產率

3) 對于具有不利于轉錄反應的二級結構的 mRNA 的轉錄，使用最適溫度為 42℃ 的禽源反轉錄酶可能取得較好的結果。

4）除使用 oligo(dt)_12-18 外，在反轉錄反府中也可以使用長度為 6 的隨機寡聚核苷酸。

5) 隨若基因芯片技術的發展和逐漸普及應用，產生了由 mRNA 反轉彔而獲得熒光標記 cDNA 探針的方法。與常用的 RNA 探針同位素標記不同之處就在于其加入了熒光染料 Cy3 或 Cy5 代替了冋位素標記的 dNTP。