3.8脫氧核酶切割RNA專一位點

脫氧核酶無RNA酶的DMA酶切割底物RNA

5X反應緩沖液5X乙酸鎂或氯化鎂無水乙醇水飽和酚

一、材料與設備

1) 脫氧核酶 (其設計與制格參見脫氧核酶相關章節）

2)5X 反應緩沖液：750Tnmol/LNaCl，200 mmol/LTris-HCl (pH8.0)

3)5X 乙酸鎂或氯化鎂：300 mmol/L

4) 無 RNA 酶的 DMA 酶

5) 切割底物 RNA

6) 無水乙醇

7) 水飽和酚


二、操作方法

1) 脫氧核酶切割底物 RNA 反應體系：加入底物 RNA(終濃度為 1~10umol/L、脫氧核酶 (終濃度為 30umol/L)、反應緩沖液 (終濃度為 15 mmol/LNaCl)，4 mmol/LTris-HCl(pH8.0)

2) 于 95°C 加熱 3~4 min 從而變性 RNA 底物和脫氧核酶，然后置于冰上 5 min

3) 再于 25℃ 溫育 10 min

4) 添加 5X 反應緩沖液，使反應緩沖液的濃度達到 1X 反應緩沖液的濃度. 反應溫度提高到 37~42℃

5) 加入 5X 乙酸鎂或氯化鎂，使鎂離子濃度達到 60 mmol/L, 從而啟動脫氧核酶的切割反應。

6) 依據底物 RNA 和脫氧核酶的不同，反應時間在 30 min~4 h。

7) 反應結束，將反應管置于冰上，用乙醇沉淀回收 RNA。

8) 如果脫氧核酶千擾后續反應，可在乙醇沉淀后，用 100ul 無 RNA 酶的水溶解，再加 15ulDNA 酶，于 37℃ 反應 lh，酚抽提，乙醇沉淀，再通過變性聚丙烯酰胺凝膠分離純化。

1) 反應體系的低鹽濃度有利于脫氧核酶與底物 RNA 的特異件結合. 且降低非特異結合。

2) 不同的底物 RNA 和小同的脫氧核酶的切割反應的最適反應條件不完全相時，可以通過小反應體積試驗獲得 K 適反應條件，再進行大規模制備。需要優化的反應條件包括: 鎂離子濃度、底物 RNA 與脫氧核酶的比例、脫氣核酶的濃度、反應溫度、反應時間等。

3) 在有些特定反應中可以在反應緩沖液中加入尿素。

4) 依據 DNAzyme 與底物 RNA 結合序列的不同，脫氧核酶分為快反應和慢反應兩大類. 對于怏反成酶，般于 37°C 反應 5 min，即可完全切割底物 RNA; 對于慢反應酶，一般于 37℃ 反應 4 h, 切割效率也只能達到 40% 左右。