4分鐘教你學會多重PCR引物設計

設計策略

MPCR 要求所有的引物對在同一條件下擴增其各自的特異序列。大多數多元 PCR 反應 局限于擴增 5~10 個目的片段，原因之一是反應中，每另加入一對引物會導致一定程度的靈活性的丟失。引物數量的增加也使引物二聚體和非特異擴增出現的概率增加。因此，進行多元 PCR 要求周密計劃，且需多次嘗試，使反應條件優化。

理論上，一個多元反應中，所有引物擴增其特異序列的效率應該是一樣的，但通常是很難預測一對引物的效率。在相似條件下，退火溫度幾乎相同的寡核苷酸可更好地工作。

多元 PCR 引物設計和優化的一般規律

當設計 MPCR 引物時，除了引物設計的一般規律外，其他一些因素也必須考慮。一般 來說，一個多元反應中使用的所有引物的 Tm 值應該接近，要避免 3'-核苷酸互補，每一對引物應獨立地優化其反應條件。一旦將引物集中，需按順序混合，然后再進行優化。

1. 引物長度應為 18~24 個堿基，較長的引物更容易形成引物二聚體。

2. 對于 MPCR，退火溫度和循環數非常關鍵。要盡可能提髙退火溫度，要確認每一對 引物單獨擴增時的退火溫度，然后在多元 PCR 反應時采用最低的退火溫度。同樣，要采用最少的擴增數。

3. 由于多個模板同時擴增，酶量和核苷酸濃度可能成為限制因子，而且完全合成所有 產物所需的時間增加。因此，優化每個反應的試劑濃度和延伸時間就顯得非常重要。相對于 單個目的序列的 PCR 而言，多元 PCR 所需延伸時間較長。