4，9脫水河豚毒素國家標準樣品的研制

4，9-脫水河豚毒素(4，9-anhydrotetrodotoxin)是一種氨基全氫喹唑啉型化合物，與河豚毒素結構極其相似，是河豚毒素的一種重要衍生物，在自然界中與河豚毒素共存，主要存在于河豚魚的卵巢、肝臟、皮膚和腸胃中。4，9-脫水河豚毒素跟河豚毒素一樣，也是神經細胞膜Na+通道的阻斷劑，其生理作用是可快速阻斷Na+通道，可廣泛應用于神經生物學、生理學及其它科學研究。4，9-脫水河豚毒素的生物毒性比河豚毒素更弱，表現出更大的生物安全性，是一種具有廣闊藥用前景的化合物。目前，國內外未見4，9-脫水河豚毒素標準樣品研制的報道，也無4，9-脫水河豚毒素純品可以購買，限制了對4，9-脫水河豚毒素的深入研究。4，9-脫水河豚毒素國家標準樣品的研制，能解決海洋天然活性物質結構近似的河豚毒素衍生物化合物難以分離的共性技術問題，提供4，9-脫水河豚毒素純品實物樣品，為進一步的生物活性研究提供物質基礎，加速4，9-脫水河豚毒素的理論研究與應用基礎研究進程，為海洋生物毒素藥源開發與藥用研究提供物質基礎和重要依據。為此筆者研制了4，9-脫水河豚毒素標準樣品。

1實驗部分

1．1主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters Alliances 系列，（Waters 2695 separations Module，Waters 2475 MultiλFluorescence Detector，Waters Reagent Manager，Waters Temperation Control Module II，Waters PostColumn Reaction Module），美國Waters 公司；紫外可見分光光度計：HP–8452 型，美國惠普公司；

紅外光譜儀：Nicolet Ftir–670 型，美國ThermoScientific 公司；

高分辨質譜儀：Lct Premier TM XE 型，美國Waters公司；

天平：AL／104型，瑞士梅特勒–托利多集團；

純水機：Milli–Q型，美國Millipore公司；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

庚烷磺酸鈉：分析純，美國Regis Technologies公司；

實驗用水均來自Milli –Q 純水系統。

1．2脫水河豚毒素樣品的制備

以河豚魚卵巢為原料，首先經浸提、預過濾、膜分離、濃縮等步驟后獲得毒素粗品，然后再采用制備色譜分離、濃縮、結晶、干燥等精制方法獲得純度不小于97%的4，9-脫水河豚毒素。

1．3定性分析

采用紅外吸收光譜、高分辨質譜及核磁共振譜等對脫水河豚毒素標準樣品進行定性分析。

1．4定值分析

標準樣品定值一般情況下采用技術有效、嚴謹認可的方法來完成。4，9-脫水河豚毒素的特定檢測方法未見相關報道。由于4，9-脫水河豚毒素與河豚毒素有類似的結構，在NaOH溶液中加熱同樣能產生帶有熒光的物質，可以利用熒光檢測器測定4，9-脫水河豚毒素的含量，因此選擇柱后衍生高效液相色譜–熒光法進行測定。

1.4.1色譜條件

色譜柱：ZORBAX C8(250 mm×4.6 mm，5 μm)；

流動相：庚烷磺酸鈉的磷酸鹽緩沖液(庚烷磺酸鈉濃度為2.5 mmol／L，磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉濃度為0.03 mol／L)，流量為0.3 mL／min；熒光檢測波長：激發波長為365 nm，發射波長為510 nm；進樣體積：10 μL；衍生試劑：4 mol／L氫氧化鈉；柱溫：28℃；檢測器：Waters 2475型熒光檢測器。

1.4.2樣品溶液配制

打開蓋子后，往西林瓶里加適量的0.03% HAc溶液溶解，然后轉移到100 mL的容量瓶，再洗西林瓶5次，并將洗液轉移到量瓶中，稀釋至標線。然后按照上述的色譜條件進行純度檢測，每個樣品重復進樣3次。

1．5均勻性檢驗

標準樣品均勻性是指特性量值在空間分布的均勻程度，它是對標準樣品總體空間分布的評價，是標準樣品的重要質量指標之一。對同一批制備的脫水河豚毒素樣品進行分裝，每瓶標準樣品凈重為1.000 mg，共140瓶。按照GB／T 15000.3–2008規定，本項目確定抽樣數目為15個，采用單因素多水平試驗方差分析法對4，9-脫水河豚毒素標準樣品進行純度均勻性檢驗，測定方法采用柱后衍生高效液相色譜–熒光法，每個樣品重復測定3次。檢測數據用方差分析法進行分析以判斷標準樣品的均勻性是否合格。

1．6穩定性檢驗

為了考察樣品的穩定性，確定其有效期，取本標準樣品模擬上市包裝，在溫度為(40±2)℃、相對濕度為75%±5%的條件下進行加速試驗6個月。分別于1、2、3、6個月取樣，在1.4.1色譜條件下進行檢測，考察其樣品純度的變化。

2結果與討論

2．1脫水河豚毒素的定性分析

脫水河豚毒素通過紅外吸收光譜、高分辨質譜及核磁共振譜進行定性分析。

4，9-脫水河豚毒素的結構式見圖1。對該樣品進行核磁共振測試，核磁數據見表1。從表1可知，該化合物的各質子、各碳的化學位移與文獻數據基本一致，且質子個數、碳原子個數與脫水河豚毒素的分子式一致。

樣品的紅外光譜說明結構中存在羥基、胺基、胍和亞甲基等，與脫水河豚毒素的官能團一致。高分辨質譜測得該樣品的精確質量數為302.0971，與脫水河豚毒素的質子加合峰一致（理論值C₁₁H₁₆N₃O₇［M+H］+302.0988）。綜上所述，可以確證該樣品是脫水河豚毒素。

2．2均勻性試驗

標準樣品的均勻性檢驗是標準樣品研制過程中不可缺少的程序。因此在對樣品進行分裝后，對4，9-脫水河豚毒素標準樣品進行純度均勻性檢驗，均勻性檢驗結果見表2與表3。

F_{(0.05，14，30)} ＝2.04，由表3可知，F＜F_{(0.05，14，30)} ，說明在95%的置信區間4，9-脫水河豚毒素樣品均勻性良好。

2．3穩定性試驗

按1.6進行穩定性重點考察項目檢測試驗，結果見表4。

采用直線模型作為經驗模型，對4，9-脫水河豚毒素長期穩定性獲得的數據進行分析。

自由度為n–2和P＝0.95(95%置信水平)的t因子t _0.95，n–2＝3.18。t _0.95，n–2·s(b1) ＝3.18×0.006 248＝0.019 619，

由于|b1| ＜t _0.95，n–2·s(b1)，故斜率不顯著，因而未觀測到不穩定性，說明經(40±2)℃、相對濕度(75±5)%加速試驗樣品穩定性良好。

參照藥典的說明，如果樣品在加速試驗條件下(30～40℃，RH＝75%，3個月)，各項質量仍然良好，可初步確定其穩定性為2年。因此將4，9-脫水河豚毒素國家標準樣品的最終有效期暫定為2年。

2．4定值結果及其不確定度評定

2.4.1定值結果

4，9-脫水河豚毒素標準樣品按照GB／T15000.3–2008標準要求，采用多個實驗室協作定值，選擇獲得國家或部門認可的具備資質的8家實驗室進行樣品定值。隨機抽取8瓶樣品，每個定值實驗室送1瓶，采用柱后衍生高效液相色譜熒光法進行測定，應用面積歸一法進行定量，定值結果見表5。

匯集各家實驗室的檢測數據后，對每家實驗室的數據按大小順序排列，用Grubb’s法和峰度法正態性檢驗組內數據的異常值，結果沒有異常值。所有數據進行下一步統計，用Grubb’s法對每家實驗室的平均值進行檢驗，將其看成一組測定值進行異常值檢驗，經檢驗無異常值。因此將各家實驗室測得的數據作為無偏估計值，計算8家測定結果的平均值及標準偏差。然后對各實驗室測定結果的標準偏差S進行Cochran檢驗，計算統計量：

式中：S_i——各實驗室測定結果的標準偏差；

S_max——Si 中的最大值。

C _8，6(0.05) ＝0.360，C＞C _8，3(0.05) ，表明各實驗室間的測量不屬于等精度測量，因此計算加權平均值作為最佳值得到脫水河豚毒素標準樣品的定值結果。總平均值X＝97.77%。

2.4.2定值結果的不確定度評定

根據GB／T 15000.3–2008標準規定，定值結果由標準值和不確定度組成。標準樣品特性標準值的測量不確定度u由標準值定值實驗引入的不確定度u(X)、均勻性檢驗引入的不確定度ubb和穩定性檢驗引入的不確定度ults 組成。依據全部測定結果，計算4，9-脫水河豚毒素標準樣品的特性標準值和不確定度。

（1）標準值定值試驗引入的不確定度u(X)。

按照加權法計算得到標準樣品定值的不確定度u(X)=0.19%。

（2）均勻性檢驗引入的不確定度ubb。瓶間方差：

式中：MS_among——組間均方差，來自表3；

MS_within——組內均方差，來自表3。

則均勻性檢驗引入的不確定度：

u_bb＝s_bb＝0.03％

（3）穩定性檢驗引入的不確定度ults。由2.3穩定性檢驗試驗可知，穩定性檢驗引入的不確定度：

u_lts ＝s(b1)t＝0.006 248×6＝0.04％標準樣品定值結果的不確定度：

擴展不確定度：

U₉₅＝ku＝1.96×0.20％＝0.40％

4，9-脫水河豚毒素標準樣品的定值結果：97.77%±0.40%(k＝1.96)。

3結語

研制了4，9-脫水河豚毒素標準樣品脫水河豚毒素標準樣品，對其進行了均勻性檢驗、穩定性考察，結果表明該標準樣品符合標準樣品均勻性與穩定性的要求。研制的4，9-脫水河豚毒素標準樣品對食品安全、環境監測、衛生檢驗檢疫等方面的測量和科學研究提供了技術支撐和量值溯源保證，具有重要意義。

（作者：陳偉珠，謝全靈，張怡評，洪專，方華，洪碧紅，易瑞灶）

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