5羥基吲哚乙酸（5HIAA）ELISA試劑盒使用說明（二）

5、實驗所需器材（但試劑盒不提供）

移液器（20；25；50；100；1000μL）

玻璃檢測用試管（12×75mm）

旋渦混合器

帶儲器的8通道移液器

洗滌瓶，自動或半自動包被板清洗系統

酶標儀

雙蒸水或去離子水

通風櫥

吸水紙，取樣吸頭，計時器

6、實驗前的準備說明

供手動操作和自動操作用：

注意	此96人份的檢測試劑可分成3次獨立的實驗進行。下列體積為用四條包被板（32人份）進行一次檢測所需要的試劑的量。如果客戶想將標準品的量由7個減為6個，您可去掉標準品G。則實驗結果的報告范圍相應的減少到3000μg/L

6.1凍干粉或濃縮成分的制備

6.2樣品的稀釋

樣品中5-HIAA膿渡高于最高標準品的應在甲基化后用檢測緩沖液進行進一步的稀釋。

7、第一天

7.1質控品和病人樣品的稀釋（除標準外）

樣品的準備將導致255倍的稀釋。但這已將此考慮到標準品濃渡中。

注意	不要甲基化標準品，它已經被甲基化了。
1）	將質控品和樣品分別20μL加入到相應的玻璃試管中。
2）	完成次操作步驟后，請在通風櫥內繼續操作。
3）	在每一支試管中加入50μL稀釋液。旋渦混合器上混合。
4）	在每一試管中加入25μL甲基化試劑。加入試劑后立即混合試管內溶液。注意：反應混合物的黃顏色應當持續穩定，如果顏色迅速消失說明樣品中酸的量過大。在這種情況下在向試管中加20μL甲基化試劑。
5）	蓋好試管，室溫（18-25℃）下溫育20min
6）	在每一試管中加入5ml已稀釋好的檢測緩沖液。用塞子蓋好是試管并旋轉幾次。手動或用混合器上下混合最少五次，以便液體能充分混合。
7）	完成此步驟后就可以不要才通風櫥下操作了。
8）	吸取50μL上清液，立即進行ELISA實驗。上清液室溫下可穩定存放1h。

8.2 ELISA操作

1）	將標準品、甲基化質控品和甲基化病人樣品分別50μL加入到相應的微孔。
2）	在每一微孔中加入50μL 5-HIAA生物素。
3）	在每一微孔中加入50μL 5-HIAA抗血清。
4）	蓋板，小心振動包被板。2-8℃下溫育一夜（16-20h）。

8、第二天

1）	移去金屬板，棄取孔內反應液，用250μL洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干。
2）	每孔加入150μL臨時配置好的酶聯物
3)	用一新的粘性金屬蓋板。室溫環境（18-25℃）下，在軌道搖床（500rpm）上溫育120min.
4)	在溫育結屬前大約10min的樣子時，向微孔中加入酶聯物。
5）	移去金屬板，棄去孔內反應液，用250μL已稀釋好的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干。
6）	在加入底物液和終止液時，如果有條件的話，可使用8道移液器進行加液。加底物液和終止液必須按相同的時間間隔進行，避免氣泡產生。
7）	在每一微孔中加入200μL臨時配置好的PNPP底物液。
8）	室溫（18-25℃）環境下，在軌道搖床上溫育60min。
9）	在每一微孔中加入50μL PNPP終止液以終止反應。輕輕搖動包被板以混合各種成分。
10）	加入終止液后60min之內在405nm處測OD值（參考波長：600-650nm）。

9、參考值

實驗結果不能當作進行醫療診斷的唯一因素，醫療診斷還與其它臨床觀察和其它診斷測試相關。

以下為明顯健康人群5-HIAA的正常值：（97.5%）

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。