概述
日前，國家藥監局、國家衛生健康委聯合發布《中國藥典》（2020年版）第一增補本，將于2024年3月12日起施行。其中增加了《9405 糖蛋白的糖基化分析指導原則》，本指導原則詳細闡述了糖蛋白糖基化分析的理念、方法及應用和驗證的相關要求，適用于糖蛋白產品結構與穩定性的表征、批次放行檢測和過程控制檢測以及產品間可比性評估等。本指導原則的實施，將進一步指導廣大生物制藥用戶對糖蛋白糖基化的分析。
為此，今天我們重點回顧一下《中國藥典》中對糖蛋白糖基化分析的相關法規和指導要求，聚焦不同的分析策略，結合多種高糖基化復雜蛋白藥物如重組人促紅細胞生成素（rhEPO）、重組人血小板生成素（rhTPO）、依那西普（Enbrel）等樣品，充分展示了SCIEX ZenoTOF? 7600 系統在糖基化分析中的優異的性能。
1. 9405 糖蛋白的糖基化分析指導原則
糖蛋白的糖基化是通過糖基受體、糖基供體和糖基轉移酶三種分子的協同作用將單糖或寡糖以糖苷鍵形式連接在蛋白質的氨基酸殘基上，是蛋白質的一種翻譯后修飾。糖蛋白的糖基化結構復雜，且在生物合成過程中可受多種因素影響產生異質性，糖基化對治療糖蛋白的功能、藥代動力學、藥效學、穩定性和免疫原性等有著顯著的影響。因此糖基化分析對于藥物開中的活性成分鑒定及產品質量控制等具有重要意義。《9405 糖蛋白的糖基化分析指導原則》包含的分析內容及方法如下：
2. 糖蛋白糖基化分析的挑戰
及其對質譜系統的要求
糖蛋白糖基化分析的挑戰主要涉及以下幾個方面：
1糖型種類多樣：分為N-糖基化和O-糖基化。
N-糖基化：其修飾的目標序列具有保守性，擁有相同的五糖核心結構，可以采用一種通用酶（如PNGase F酶）將N-糖酶切，分析較為容易；
O-糖基化：沒有特征的修飾序列可做修飾位點的預測，并且O-糖基化的糖基結構比較復雜，分析難度較大。
2糖基異質性強：同一蛋白不同位點的修飾水平不一，同一位點所攜帶的糖鏈也會存在多種結構。
LC-MS方法能夠從完整蛋白、糖肽和游離寡糖三個水平對蛋白藥物的糖基化修飾進行深度全面的分析，然而不同分析策略的側重點會有差異，并且對高分辨質譜儀器具有很高的要求，具體如下：
3. 高分辨質譜ZenoTOF? 7600 系統
特點及其在糖基化分析中的應對策略
高分辨質譜ZenoTOF? 7600 系統是SCIEX在2021年推出的全新三合一高分辨質譜儀（如圖1），除了延續SCIEX高分辨質譜系統分辨率高、質量精度高、穩定性好、采集速度快的優勢之外，還整合了2項革命性的創新技術電子活化解離（Electron-activated dissociation，EAD）技術和Zeno?Trap（Zeno阱）富集技術。高分辨質譜ZenoTOF? 7600 系統提供的EAD技術碎裂能量連續可調，可以實現一系列基于電子的碎裂機制，產生豐富的二級碎片。并且，EAD技術無需試劑就可以產生電子裂解，使用非常方便。ZenoTOF? 7600 系統配備的Zeno阱富集技術，能夠提供接近100%的高占空比，二級離子利用率高，可以提升10-20倍的靈敏度。
ZenoTOF? 7600 系統的硬件特點及在蛋白藥物糖基化分析中的主要應用優勢如下：
圖1. 高分辨質譜 ZenoTOF 7600 系統和數據分析軟件Biologics Exploer軟件示意圖
4. 高分辨質譜ZenoTOF? 7600 系統
在糖蛋白糖基化表征中的應用案例分享
本文以高度糖基化的復雜蛋白藥物如重組人促紅細胞生成素（rhEPO）、重組人血小板生成素（rhTPO）、依那西普（Enbrel）等樣品為例，分別從三種不同分析策略下對蛋白藥物糖基化的表征，充分體現出ZenoTOF? 7600 系統在蛋白藥物糖基化分析中的技術優勢。
a完整蛋白水平
圖2主要展示了三種高糖基化蛋白藥物（rhEPO、rhTPO、Enbrel）中攜帶不同類型以及不同個數O-糖的糖蛋白整體分布情況。EPO含有3個N-糖基化位點和1個O-糖基化位點，糖鏈約占總分子量的40%。從完整蛋白水平上進行O-糖基化分析時，可采用PNGase F酶切除N-糖，降低EPO樣品的異質性。與EPO類似，rhTPO和依那西普的異質性也非常高，但是不同點在于rhTPO和Enbrel的異質性主要表現為含有較多的O-糖基化位點，并且O-糖中存在較高比例的唾液酸化。因此，在實驗前處理中除了需要去除N糖外，還需要去除O-糖外端的唾液酸，進一步降低rhTPO的異質性，從而提高完整蛋白分析中一級譜圖的質量。通過對去卷積譜圖進行分析，rhEPO中主要的O-糖型為Core1_S1和Core2_S2；rhTPO中的主要O-糖型為Core1；Enbrel中的主要O-糖型為Core1和Core2。此外，根據完整蛋白去卷積譜圖的峰面積還可以計算出O-糖基化修飾的比例。
圖2. 復雜蛋白藥物完整蛋白水平的糖基化分析去卷積譜圖。圖2A為去除N-糖的rhEPO樣品；圖2B為去除N-糖和唾液酸的rhTPO樣品；圖2C為去除N-糖和唾液酸的Enbrel樣品。
b糖肽水平
如圖4A所示，在CID碎裂模式下，糖苷鍵會更容易斷裂，寡糖部分優先碎裂，降低了肽段的碎裂效率。如圖4B所示，ZenoTOF? 7600 系統特有的EAD技術可以最大程度上保留二級離子中糖鏈的完整性以及糖鏈與肽段之間糖苷鍵的完整性，肽段部分能夠產生豐富的二級離子，從而提升了肽段骨架的二級離子覆蓋率，有利于糖基化位點的確認及其糖型的準確鑒定。此外，ZenoTOF? 7600 系統的Zeno阱富集功能，可以有效提高低含量糖肽的靈敏度，進而提高糖肽二級譜圖的質量，確保糖基化分析的準確度。相比于完整蛋白水平的糖基化分析，糖肽水平的分析從新一維度上展現了蛋白藥物的糖基化水平，二者可以相互驗證和補充。
圖4. rhEPO樣品中N-糖肽AEN(24)ITTGCAE + (A4G3F1_OMe1)在CID(A) 和EAD(B)兩種不同碎裂方式下的二級質譜圖。b-離子/c-離子用藍色線標識，y-離子/z-離子用紅色線標識，B-離子/Y-離子用黃色線標識。
c游離寡糖、單糖水平
游離寡糖水平的糖基化分析首先通過使用特異性酶切（如PNGase F酶）的方式，將N-寡糖從糖蛋白上釋放出來，將游離N-糖進行熒光標記（如2-AB、普魯卡因胺等），再通過LC-MS分析。通過衍生化處理后，可以有效提高寡糖的離子化效率，結合ZenoTOF? 7600 系統特有的Zeno阱富集技術，極大程度上提升了游離寡糖分析的靈敏度。通過SCIEX OS軟件進行分析，可以獲得多種寡糖類型的結構（如高甘露糖型、雜合型、復雜型、唾液酸化程度等）以及相對含量的信息，從而實現寡糖的鑒別與定量。SCIEX推出的N-糖數據庫，集成了CHO表達體系中常見的236種N糖，能覆蓋常見單抗及多數融合蛋白的N糖種類，使用非常方便。下表展示了rhTPO中主要的N-寡糖種類及其含量，其中FA2G2糖型的占比最高（~23.7%）。通過游離寡糖的分析可以從整體上監測蛋白藥物的糖型種類及含量，也是確保產品的質量、安全性和療效的重要手段之一。
5. 總結
糖基化作為蛋白藥物重要的翻譯后修飾之一，對于蛋白藥物的安全性和有效性至關重要，在蛋白藥物的生產過程中需要采取適當的方法進行嚴格的監控。基于高分辨質譜系統的LC-MS方法是蛋白藥物結構表征的必選方法，可以多維度充分滿足蛋白藥物糖基化的表征需求，包括完整蛋白水平、糖肽水平以及游離寡糖水平。通過對糖基化的深度分析，可以有效幫助生物藥企業對蛋白藥物的批間一致性，以及原研藥和生物類似藥的一致性進行分析。高分辨質譜ZenoTOF? 7600 系統在蛋白藥物糖基化分析中優勢顯著，主要體現在以下幾個方面：
1EAD碎裂技術有助于糖基化位點的準確鑒定
2創新的Zeno阱富集技術提升糖肽和寡糖分析的靈敏度
3高達133Hz的超快速的掃描速度有助于提高二級譜圖質量
4功能強大的數據處理軟件
6. SCIEX 應用文集
ZenoTOF 7600 系統對EPO中N-糖基化和O-糖基化修飾的表征
ZenoTOF 7600 系統對rhTPO中O-糖基化修飾的全面表征
ZenoTOF 7600 系統對依那西普生物類似藥O-糖基化深度表征和比較
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應用文集
