ACEHILIC色譜柱方法開發指南ⅢHILIC法色譜條件

HILIC流動相

HILIC模式中用作流動相的溶劑類似于RPLC模式下所用的溶劑。

流動相條件是各種HILIC保留機制的關鍵因素。

通過改變洗脫液中有機組分和水組分的比例，可以改變分析的保留率。

在HILIC模式下，保留因子建議保持在1.5-10之間。

有機改性劑

HILIC中最常用的有機改性劑是非質子溶劑乙腈。

乙腈作為較弱的洗脫溶劑與水結合使用（見圖5）。

與RPLC不同，增加流動相中的有機物含量百分比，可增大分析物的保留率。

乙腈具有粘度（粘度低）和紫外線切斷（截止波長）較低等優點。

由于能夠干擾固定相周圍的水層，所以散裝（主體）溶劑中通常要避免甲醇等質子溶劑。

這些溶劑可以形成氫鍵，從而破壞分析物分散（分配能力）。
但是，也存在極性溶劑（如甲醇和2-異丙醇（IPA））與水性部分結合使用以影響分離選擇性的各種情況。

如果所有其它參數不能實現足夠的分離[6]，這通常作為最后的方法來使用。

洗脫劑pH值

洗脫劑的pH值對于方法開發來說是一個有用的參數。

如果pH值高于或低于可電離物質的pKa，則分析物的電離狀態會發生改變，反過來會影響它的親水性。

因此，這會影響（影響可電離分析物）與固定相的潛在相互作用，并且還會影響保留。

此外，pH值也會影響固定相表面的極性，進而影響到保留機制。

了解分析物的pKa非常有助于pH選擇。若可能的話，建議與pKa相差2個pH單位，以達到特定的方法穩定性。對于酸性物質，低于pKa將使分析物主要以非電離狀態存在。

在酸性分析物pKa的2個pH單位以上將使大部分分析物電離。對于堿性物質，正好相反。

為了進行方法開發，建議對（在）三種不同pH值條件下各種（用三款）ACE HILIC色譜柱的（對）混合分析物進行評估：

pH 3.0、4.7和6.0。這種方法探索了不同洗脫劑pH值條件下使用不同固定相時的選擇性差異，而且經證明對HILIC方法開發是有效的。

例如，ACE HILIC-A相中，在pH為3.0、4.7和6.0的等度條件下，分析了包含酸性物質和中性物質的混合物（見圖6）。所有其它條件都相同。

保留和洗脫順序的差異（即選擇性差異）可清楚地看出，這一單個HILIC相的pH值不同。

圖6

ACE HILIC-A相中，不同流動相pH值下六種極性分析物的分析中性物-綠色酸-紅色

色譜柱：150 x 4.6 mm, 5 μm

流動相：10 mM甲酸銨（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）

流速：1.5 mL/min

檢測：UV, 254 nm

溫度：25 °C

進樣：5 μL

樣本：

1) 4-氨基苯甲酸

2) 4-羥基苯甲酸

3) 煙酰胺

4) 扁桃酸

5) 腺嘌呤

6) 2’-脫氧鳥苷

緩沖液濃度

HILIC中可使用各種緩沖鹽，但緩沖鹽必須可溶解于高有機物含量的（含有高比例有機物的）洗脫劑中。

這就排除了像磷酸鹽這樣的無機緩沖鹽。

甲酸銨緩沖鹽比較適宜，因為它們在低pH范圍內具有緩沖能力，并在高乙腈含量的洗脫劑中具有良好的溶解性。

HILIC的緩沖液濃度范圍通常為2-18mM。

緩沖液濃度對保留率和選擇性的影響取決于分析物和固定相的特性。

例如，圖7顯示了pH為3.0時，通過ACE HILIC-A固定相，甲酸銨緩沖液的濃度對三（三種）組分（極性的酸性、堿性和中性分析物）混合物分析物保留率（保留）的影響。

洗脫劑濃度低（洗脫劑的低pH）意味著：酸吡哆醛（峰1）以離子抑制或中性的形式存在。胞啶（峰2）是一種極性的中性分析物。

普魯卡因胺（峰3）是一種帶電的極性堿。在ACE HILIC-A相的這些條件下，極性堿的保留率顯著下降，而（隨著）緩沖液濃度增大（隨著緩沖液濃度增大，極性堿的保留率顯著下降）。

極性堿很可能主要是通過與帶電酸性固定相進行離子交換的方式來保留。

緩沖強度的增加會使（與）堿性分析物形成競爭，并且保留率隨后會因離子交換機制的耗盡而減小。

圖7

緩沖液強度對分析物保留率的影響

色譜柱：ACE 5 HILIC-A,150 x 4.6 mm

流動相：甲酸銨，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）

流速：1.5 mL/min

檢測：UV, 254 nm

溫度：25 °C

進樣：5 μL

樣本：

1) 吡哆醛

2) 胞啶

3) 普魯卡因胺

樣品稀釋液

HILIC模式下，由于分析物溶解性以及稀釋液與HILIC洗脫劑不匹配等問題，通常較難選擇合適的樣本（樣品）稀釋液。

選擇優化不足的稀釋液會大大降低色譜性能和峰形。

通常，樣本稀釋液對各種分析物的影響不一樣，并且這種行為因固定相的選擇和洗脫劑的條件而存在差異。

因此，對樣本稀釋液的優化往往是針對特定應用的研究。

一般來說，建議增量為20%，緩沖比介于20%到80%之間（建議20%的乙腈增量讓其處于緩沖比20%-80%之間來探索樣品稀釋方法）。

例如，圖8（第16頁）顯示了pH為3.0時，三個ACE HILIC相中的每一個相（固定相）上酸性、堿性和中性分析物的峰形，其中研究了樣本（在這三個固定相上的研究樣品）稀釋液乙腈（MeCN）的百分比。

通常，次黃嘌呤（極性中性）的峰形會隨著所有ACE HILIC相有機濃度的增大而改善。

然而，分析物未能在100%的乙腈中溶解。

這種分析物最有效的樣本（樣品）稀釋液是60-80%的乙腈。

在樣本稀釋液中乙腈濃度較低的情況下，酪胺（堿性分析物）顯示了ACE HILIC-B相和ACE HILIC-N相的分裂峰。

然而，這種效果對ACE HILIC-A并沒有那么明顯，峰形仍然很差。

對于60%以上的乙腈，所有ACE HILIC相的峰形都有改善。

扁桃酸的峰形通常不受ACE HILIC-B和ACE HILIC-N的樣本（品）稀釋液的影響。但是，對于ACE HILIC-A，有機濃度較低時峰形較差。

根據這個數據集，對于該HILIC應用，建議使用60-80%的乙腈樣本（樣品）稀釋液。

對于各HILIC應用，建議進行此類系統研究。

如果可能的話，最好采用較高濃度的分析物和較小的進樣量。

這樣可盡量減少（盡可能減少）對吸附水層的破壞。

樣本（樣品）溶解性與樣本（樣品）濃度之間的平衡（權衡）始終具有挑戰，尤其是對于HILIC而言。

圖8

（a）ACE HILIC-A相（b）ACE HILIC-B相和（c）ACE HILIC-N相中樣本溶液對次黃嘌呤、酪胺和扁桃酸的色譜峰形的影響。

色譜柱：150 x 4.6 mm, 5μm

流動相：甲酸銨，pH4.7，（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）

流速：1.5mL/min

溫度：25 °C

檢測：UV, 254 nm

進樣：5 μL

溫度

溫度是方法開發中一個很有用的參數。

溫度對保留的影響程度取決于固定相和分析物二者。例如，分析物的pKa可能隨著溫度的變化而變化，從而影響電離和保留的程度。

據記載，對于HILIC，隨著溫度的升高，保留率有可能同時增加和減少，如圖9中所示，分離出極性的酸性、堿性和中性分析物（極性的酸性、堿性和中性分析物的分離）。

在HILIC方法開發中，建議不要將溫度作為優化選擇性和分離的主要參數。

與色譜柱化學特性、有機物含量百分比或洗脫劑pH值等參數相比，在HILIC模式下它能改變保留率（保留的作用微弱）。

圖9

下列相中溫度對酸性、堿性和中性分析物混合物的分析物保留率的影響:

(a) ACE 5 HILIC-A

(b) ACE 5 HILIC-N

(c) ACE 5 HILIC-B

色譜柱：150 x 4.6 mm

流動相：10 mM甲酸銨，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）

流速：1.5 mL/min

檢測：UV, 230 nm

進樣：5 μL

樣本：

1) 4-羥基苯甲酸

2) 沙丁胺醇

3) 2’-脫氧鳥苷

4) 色氨酸