ACEHILIC色譜柱方法開發指南ⅣHILIC儀器兼容性

ACE HILIC色譜柱檢測器兼容性

HILIC是一種能很好兼容眾多主流檢測器的技術。因此，檢測的（檢測器的）選擇受檢測器可用性、所需的檢測限制和分析物的理化特性（即：具有發色團或電荷）等綜合因素的影響。

UV-Vis檢測器

UV-Vis檢測器是分析試驗室中最常見的檢測器之一。

根據儀器的不同，一次可記錄多個波長，以優化分析物覆蓋范圍。

有時，混合物中的分析物可通過參考紫外光譜庫來快速識別。

圖10中的例子示出了五種β受體阻滯劑的分離，這些阻滯劑可通過他們不同的圖譜清楚識別（識別清楚）。

圖10

五種β受體阻滯劑的色譜圖和紫外光譜

色譜柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm

流動相：10 mM甲酸銨pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）

流速：1.5 mL/min

溫度：25 °C

檢測：UV, 214 nm

樣本：

1) 普萘洛爾

2) 醋丁洛爾

3) 索他洛爾

4) 沙丁胺醇

5) 阿替洛爾

折射率檢測器

示差折光測器（RID）測量當通過檢測器時分析物峰相對參考溶劑（即流動相）的折射率。如果這二者之間存在差別，色譜圖中可觀察到峰。

RID對缺乏活性發色團的分析物很有用，尤其常用于糖分分析。

RID存在幾個方面的劣勢。這些劣勢包括靈敏度受限和沒有峰相關的信息（峰的身份通常需要單獨的標準來驗證）。

此外，RID只能用于等度條件，因為洗脫劑（洗脫劑組成變化）會改變折射率響應。

作為物理測量，折射率也很受溫度的影響，也就是說，基線噪聲和再現（重現）性會發生變化。

蒸發光散射檢測器

蒸發光散射檢測器（ELSD）通過如下方式工作：從LC上噴射輸出洗脫液與惰性氣體（通常為氮氣），以形成液滴在加熱室內去溶劑化。

去溶劑化后的分析物被分散的光源擊中，然后進行檢測（噴射出惰性氣體來霧化從LC中輸出的洗脫液，形成液滴后在加熱管中蒸發，去溶劑的分析物被分散的光源擊中然后進行檢測）。

探測器（ELSD）需要揮發性洗脫劑，以使HILIC非常適合（HILIC方法就非常適合這款檢測器）。ELSD是RID有效的替代選擇，因為它非常適合非（無）發色團分析物，靈敏度更高，并且適用于梯度色譜法。

但是，ELSD不提供光譜信息，因此在沒有標準的情況下，較難識別峰值（峰的識別很困難）。

對于HILIC分離（分析物），ELSD對發色團有限（有限發色團）的極性分析物更有利，例如甲基丙二酸（MMA）和琥珀酸（圖11）。

MMA用作維生素B12缺乏癥的生物標志，但琥珀酸與MMA等壓（元素相同），因此必須徹底解決以防止假陽性結果。

采用ELSD的HILIC法，其MMA量化比紫外線檢測法更好。

圖11

甲基丙二酸和琥珀酸的色譜圖

色譜柱：ACE 5 HILIC-B,

150 x 4.6 mm

流動相：10 mM

甲酸銨pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）

流速：1.5 mL/min

溫度：25 °C

檢測：ELSD

樣本：

1) 琥珀酸

2) MMA

質譜儀

質譜儀（MS）是LC分離中信息最豐富的檢測技術。

LC的洗脫劑流通常使用惰性氣體（如氮氣）去溶劑化（LC流出的洗脫液在加熱管中被惰性氣體去溶劑化），并在檢測前電離。

可使用不同的質譜分析儀，如：四極質譜儀、飛行時間質譜儀、離子阱質譜儀等。有機物含量較高的HILIC洗脫劑特別適合MS檢測。

有多個電離源可用，根據具體應用進行選擇。

噴霧電離質譜（ESI）很常用，但也使用電暈放電和光電離源。MS具有高度專一性，因為可利用選擇性離子檢測（SIM）進行跟蹤（因為可以使用選擇離子性監測來跟蹤單個物質的荷質比（m/z），得到更好的選擇性），提高靈敏度。MS還可以在不同質量范圍內執行掃描，這對未知的樣本（樣品）很有幫助。

但是，MS掃描通常靈敏度小得多。（具有更小的靈敏度。）

MS可用于檢測發色團較弱或者沒有發色團的分析物。

作為一種識別工具，MS對HILIC應用也很有幫助，這種應用中分析物具有相似的紫外光譜特性，但質量不同（在HILIC應用中，當分析物具有相似的紫外光譜特性，但質量不同，MS是很有用的識別工具）。

核酸堿基和核苷就是一個很好的HILIC例子。極性分析物腺嘌呤、腺苷和2’-脫氧腺苷的紫外光譜非常相似（圖12）。

圖12

腺嘌呤、腺苷和2’-脫氧腺苷的紫外光譜對比

藍色軌跡：腺嘌呤

紅色軌跡：腺苷

綠色軌跡：2’-脫氧腺苷

色譜柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm

流動相：10 mM甲酸銨，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）

流速：1.5 mL/min

溫度：25 °C

檢測：UV

進樣量：2 μL

MS可利用這些分析物不同的質荷比進行檢測和識別峰（圖13）。SIM用于提高靈敏度。

圖13

利用UV和MS聯合檢測法分析ACE HILIC-N的腺嘌呤和核苷

（a）下列物質的紫外光色譜圖：

1) 2’-脫氧腺苷（m/z 252.4）

2) 腺嘌呤（m/z 136.1）

3) 腺苷（m/z 268.3）

(b) 通過MS SIM確認峰

色譜柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm

流動相：10 mM甲酸銨，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）

流速：1.5 mL/min

溫度：25 °C

檢測：UV，254nm和MS