ACE HILIC法開發平臺和工作實例圖17顯示了HILIC方法開發的流程圖。
一般方法是：收集分析物相關的信息（如果已知的話），針對三個ACE HILIC相（用三款不同的ACE HILIC色譜柱在不同的pH洗脫液條件下）執行梯度或等度HILIC篩選實驗（取決于樣本分析物的親水性范圍），然后再優化色譜法以達到可接受的HILIC法。
表1中列出了ACE HILIC篩選條件。
這些設計旨在探索廣泛的選擇性范圍，以及為達到所需分離提供一個良好的起點。
圖17
ACE HILIC 方法開發流程圖
表1
ACE HILIC篩選實驗的條件
| 參數 備注 | |
| 色譜柱 | ACE HILIC-A, ACE HILIC-B and ACE HILIC-N, 150 x 4.6 mm, 5 μm |
| 梯度流動相 | A：10 mM甲酸銨（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v） B：10 mM甲酸銨（溶于MeCN/H2O中）（50:50 v/v）甲酸銨的pH值為：3.0、4.7或6.0. |
| 梯度篩選 |
時間 %B |
| 0 | 0 |
| 15 | 100 |
| 20 | 100 |
| 21 | 0 |
| 41 | 0 |
| 等度流動相 | 10 mM甲酸銨（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）甲酸銨的pH值為：3.0、4.7或6.0. |
| 流速 | 1.5 mL/min |
| 溫度 | 25 °C |
| 檢測 | 取決于樣本（視樣品而定） |
ACE HILIC色譜柱保存方法
使用之后，ACE HILIC色譜柱應使用體積比為7:3的乙腈和水進行沖洗，清除掉所有的緩沖鹽。
然后，使用100%的異丙醇、以更低的流速進行沖洗，以便貯存。應往回擰緊色譜柱端蓋（擰緊色譜柱端蓋），并將色譜柱放回盒內。
每次分析運行之后，除非第二天要使用，否則建議采用密閉法（按長期保存的方法）清洗色譜柱，然后用異丙醇沖洗。
實例1 – 咖啡因和相關化合物
方法開發中所需的咖啡因和四種相關化合物（可可堿、茶堿、次黃嘌呤和黃嘌呤）這些化合物都是極性的中性物質，其中負log P值表示合理的親水性（log P為負值明確的表明其親水性），因此適用于HILIC（圖18）。
圖18
咖啡因和相關物質的結構和log P數據
咖啡因和相關化合物在pH為3-6的情況下不可電離，因此洗脫劑的pH幾乎不會直接影響分子。
為此，選擇pH 3.0和4.7。
固定相會受洗脫劑pH變化的影響，這可能是有利的一面。
固定相的電離變化將影響粒子周圍的水合層，這會影響分析物分散到相中（分配在固定相上）或形成氫鍵的程度。
因此，在pH3.0和pH4.7的情況下對三個固定相進行篩選，結果如圖19中所示。
新的ACE HILIC色譜柱使用60倍柱體積相互平衡（平衡），以在粒子周圍形成水合層。表1中顯示了流動相、梯度和溫度。
篩選結果顯示：三個固定相與兩個pH值之間觀察到一些選擇性差異（三個固定相在兩個pH值下的篩選結果可以看出彼此間具有選擇性的差異）。
基于篩選數據的最有效分離是針對pH為3.0下的（pH為3.0下的）ACE HILIC-N相。
這些數據選擇（選定這些條件）用于進一步優化。
圖19
ACE HILIC色譜柱的梯度篩選
條件如表1中所述，275nm條件下的檢測除外。進樣25mg/mL的咖啡因混合物2μL（使用pH3.0和pH4.7的甲酸銨，以0.5%w/w的比例混合相關物質和MeCN/H2O（90:10 v/v））
樣本：
1) 咖啡因
2) 茶堿
3) 可可堿
4) 黃嘌呤
5) 次黃嘌呤