ACSCatal封面：再造超級塑料食客

ACS Catalysis封面。最有效PET水解酶結構機制解析及性能提升改造。受訪者供圖

全世界都在為處理塑料污染苦苦掙扎。

在眾多塑料制品中，生產和使用最多的是聚對苯二甲酸乙二酯（簡稱PET塑料），目前全球年產量已近七千萬噸。

能否發展綠色溫和的PET塑料酶降解方法，并回收水解產物用于PET再生，一直是國際上苦苦探尋的難題。

近日，湖北大學生命科學學院、省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室教授郭瑞庭和陳純琪團隊在前期工作基礎之上，改造了一種目前已知最有效的PET水解酶，從而獲得活力更高、熱穩定性更佳的PET新水解酶，為發展閉環式PET生物降解平臺提供了一個有利的渠道。

2022年2月18日，該研究成果在線發表于《美國化學學會會刊—催化》（ACS Catalysis），并被選為封面文章。

降解塑料能像洗衣服一樣簡單嗎？

塑料制品的出現給人類的生活帶來了很大的便利，人們在享受塑料便利的同時，也在承受著塑料污染對自然環境和人類健康的巨大負面影響。

大多數礦泉水瓶的原料就是PET塑料。然而，PET的回收率僅有10%左右，大部分PET廢棄物以土地掩埋或焚燒法來處理——掩埋法無法徹底消除PET，焚燒則會產生溫室氣體排放，并造成二次污染。

“利用化學法進行PET的降解與循環再利用的過程中需要加入強酸、強堿或有機溶劑，并在高溫高壓下反應，這樣容易造成二次污染，且降解產物很難循環再利用。”郭瑞庭告訴《中國科學報》，解決PET塑料降解酶的難題，是他和團隊成員多年來堅持做的一件事。

2017年，該團隊在國際上首次解析了一種天然的PET塑料降解酶IsPETase的晶體結構（Nature Communications, 2017）；2021年他們又首次發現影響IsPETase水解PET的關鍵結構，并證實這是自然界中的微生物為了以塑料為食改造古老的角質酶從而進化出的PET水解酶（Nature Reviews Chemistry, 2020; Nature Catalysis, 2021）。

在此基礎上，他們繼續進行著獲得最有效PET水解酶的研究。

然而，要使PET達到最好的降解效果，需要酶能夠在PET玻璃態的溫度范圍（65-70℃）下發揮作用。論文作者、湖北大學張麗蘭告訴《中國科學報》，這是因為PET塑料大部分是有序的網狀致密結構，在較高溫度下，PET結構才會趨向于松散無序的狀態，有利于酶的進入并發生降解反應。

“如果能提高PET水解酶的耐熱性，一些PET塑料就可能通過用酶‘清洗’來回收利用，就像用洗滌劑洗掉臟衣服上的污漬一樣。”陳純琪說。

對塑料食客二次改造

陳純琪注意到了2020年法國研究團隊在Nature期刊封面報道的一個耐熱角質酶ICCG。

張麗蘭介紹，ICCG其實是科學家由一種耐熱角質酶LCC改造而來。2012年日本研究團隊在樹葉堆肥的宏基因組測序中發現了LCC，并發現它是已知所有PET水解酶中活力最高的酶之一，最適反應溫度為65℃。

為了提升LCC的效率，法國研究團隊引進了四個氨基酸的突變，并將之命名為ICCG。ICCG耐熱性提升，在72℃反應10小時可以降解90%無定形態或者預處理的PET塑料，生成的TPA單體可以被用于重新合成符合商業標準的PET塑料，也就是說可以實現循環再利用。

“ICCG為何不同于其它PET水解酶，水解活力和耐熱性都異常突出呢？如果能了解ICCG獨特的作用機制，我們也有可能從中得到啟發，獲得具有更高熱穩定性的PET水解酶。”陳純琪說。

于是，該團隊充分發揮了在結構生物學和理性設計及改造方面的研究專長，使用結構生物學的手段解析了ICCG突變體與底物MHET（PET預處理后獲得的一種降解產物）的復合體結構。

論文共同第一作者、湖北大學副教授楊云云介紹，結構解析發現，MHET結合在酶表面的活性凹槽內，ICCG四個突變氨基酸中，有兩個位于MHET的結合位點附近，第三個位于酶的表面，與MHET結合的活性凹槽鄰近，而第四個突變氨基酸I243的存在擴大了底物結合通道，這可能增加了酶與PET的結合能力。

“這個特征也揭示了I234突變體可能具有更高的PET水解活性。”郭瑞庭進一步解釋道。

ICCG與底物結合凹槽。受訪者供圖

內外兼修終成超級食客

“有了復合體結構作為基礎，我們接下來的ICCG耐熱性改造就可以做到有的放矢。”陳純琪解釋說。為了增加耐熱性，他們采取“內外兼修”的策略改造ICCG：在內增加酶內部的疏水相互作用；在外增加蛋白質表面的脯氨酸等相互作用。

由此，他們共選擇并構建了27個突變體，其中有7個突變體在90℃時比ICCG具有更高的活性。進一步將這7個突變體組合突變，篩選獲得5個活性明顯提升的三突變體。

最后優中選優，他們得到了三種活性更高、變性溫度比ICCG高出三度（98-98.9℃vs. 95.2℃） 的突變體——RIP、KIP和KRP。

“為了進一步探索突變體熱穩定性增加的分子機制，結構生物學的手段被再次運用。”陳純琪說，結果顯示，突變分別在酶的外殼、中層、核心產生了穩定結構的效果，“我們猜測是這些個別效應疊加起來增進了蛋白質整體的耐熱性。”

在文章投稿的過程中，兩位審稿人一致評論這是一個對該領域影響重大的工作，指出“該團隊繼先前報導了第一個來源于能夠分解PET塑料的細菌的PET水解酶的復合體結構，本篇論文中又再度報導了活力最強的PET水解酶與底物的復合體結構。一方面證明了該團隊結構解析的能力，另一方面，這些復合體結構信息對于將來發展PET生物降解、改造PET水解酶，具有極大的重要性。”

郭瑞庭說，這項成果更加清晰地闡述了PET水解酶的分子機制，同時也證明了增加耐熱性對PET生物降解的重要性。

不過，郭瑞庭也坦言，目前PET塑料的處理主要依靠掩埋和焚燒，化學降解方法因為產生二次污染，目前也尚未采用，而生物降解方法則受到成本限制等原因尚未投諸使用。未來如果能降低酶的生產成本、提高反應溫度所需的電費、回收分離的成本等，并配套上完善的降解工藝，才能真正實現應用。

相關論文信息：

https://doi.org/10.1021/acscatal.1c05800