ATCC細胞冷凍及解凍方法

 一、細胞冷凍保存

1、材料：

生長良好之培養細胞、新鮮培養基、DMSO（Sigma D-2650）、無菌塑料冷凍保存管（Nalgene　5000-0020）、0.4％（w/v）trypan blue（GibcoBRL15250-061）、血球計數盤與蓋玻片、等速降溫機（KRYO10SeriesII）。

2、冷凍保存方法：

（1）傳統方法：冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16～18小時（或隔夜）→液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 

（2）程序降溫：利用已設定程序的等速降溫機以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。 

3、步驟： 

（1）冷凍前一日前更換半量或全量培養基，觀察細胞生長情形。 

（2）配制冷凍保存溶液（使用前配制）：將DMSO加入新鮮培養基中，最后濃度為5～10％，混合均勻，置于室溫下待用。

（3）依細胞繼代培養之操作，收集培養之細胞，取少量細胞懸浮液（約0.1ml）計數細胞濃度及凍前存活率。

（4）離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻，分裝于已標示完全之冷凍保存管中，1ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。 

4、注意事項： 

（1）欲冷凍保存之細胞應在生長良好（logphase）且存活率高之狀態，約為80–90％致密度。 

（2）冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。

（3）注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色（以0.22micron　FGLP　Telflon過濾或是直接購買無菌產品，如Sigma D-2650），以5～10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。 

ATCC細胞 冷凍及解凍方法（4）冷凍保存之細胞濃度：

①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml 

②hybridoma：1～3×106cells/ml，細胞濃度不要太高，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后死去。 

③adherent tumor lines：5～7×106，依細胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1～3×106cells/ml 

④other suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml。 

（5）冷凍保護劑濃度為5或10％DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。 

二、冷凍細胞活化 

1、冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡。 

2、細胞活化后，約需數日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現才會恢復正常（例如產生單株抗體或是其它蛋白質）。 

3、材料 ：37℃恒溫水槽、新鮮培養基、無菌吸管/離心管/培養瓶、液氮或干冰容器 。

4、步驟： 

（1）操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。 

（2）自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。

（3）將新鮮培養基置于37℃水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內。

（4）取出冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內。 

（5）取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養基之培養容器內（稀釋比例為1：10～1：15），混合均勻，放入CO2培養箱培養。取0.1ml解凍細胞懸浮液作存活測試。

（6）解凍后是否立即去除冷凍保護劑（例如DMSO或glycerol），依細胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10ml培養基之離心管內，離心1000rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養基，混合均勻，放入CO2培養箱培養。 

（7）若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養后隔日更換培養基。