ATP的生成方式主要有兩種：底物水平磷酸化和氧化磷酸化，其中氧化磷酸化是產生ATP的主要方式。
底物水平磷酸化
生物氧化過程中，代謝物分子內能量發生重排，產生的高能磷酸鍵轉移到ADP分子上生成ATP的過程稱為底物水平磷酸化。例如在糖酵解過程中存在兩處底物水平磷酸化產生ATP：
在三羧酸循環中存在一處底物水平磷酸化，即：
生成的GTP很容易轉變為ATP。
氧化磷酸化
生物氧化過程中，產生ATP的最主要方式是氧化磷酸化。底物脫下的2H，經呼吸鏈傳遞到氧生成水時，釋放的能量將ADP磷酸化成為ATP，這個過程即為氧化磷酸化。氧化作用和磷酸化作用是兩個不同的過程，氧化作用即電子在呼吸鏈傳遞的過程放出能量，而磷酸化作用則是貯存能量，氧化和磷酸化密切偶聯在一起，實現ATP的生成 。