ATP生物發光技術的發展與應用

ATP是化學物質三磷酸腺苷的簡稱，存在于所有的生物體中（從微生物到高等動物），ATP在細胞體內主要作用是提供能量。鑒于ATP存在于所有生物體中，利用ATP發光檢測儀檢測ATP，可以間接地證明生物體的存在。隨著食品行業對食品衛生質量要求越來越高，而且ATP生物發光法在檢測食品微生物時簡單、快速且靈敏度高，因此近年來受到廣泛關注。
 

1、ATP生物發光技術的發展過程

ATP生物發光技術產生于20世紀70年代中期。1983年，Moyer等最早提出細胞內源性ATP的含量可以反映細胞的活性和活細胞的數量。同年Gronroos等也證實該技術是一種可靠、靈敏度高的確定細胞活性度的檢測方法。20世紀80年代，英國人首先研制出ATP檢測儀檢測系統，隨后發展到歐洲、美國和日本。應用范圍涉及食品加工、超市和飲食行業，檢測內容包括微生物和食品殘渣。1998年，日本國會頒布了《關于食品制造過程管理高度化臨時措施法》，其中即包含了應用ATP檢測儀檢測系統的內容。1999年，日本還成立了ATP涂抹檢查研究會，專門研究該方法的使用效率和應用領域，其內容之一就是在食品衛生監測領域中，解決現場微生物的檢測問題。20世紀末，一些ATP檢測儀檢測系統及技術被引進我國，到目前為止，除個別省級衛生監督檢測單位裝備外，主要是在一些外資或合資企業中自行檢測使用。2002年，我國衛生部頒發了食品加工企業HACCP實施指南，鼓勵食品加工企業引入ATP檢測系統。近年來，蟲熒光素酶已通過基因工程生產，價格大幅度降低，隨著相關儀器的小型化，ATP生物發光技術必將會在國內相關行業得到迅速普及 。
 

2、ATP生物發光法菌落計數與傳統方法的比較

2.1  ATP生物發光法菌落計數

ATP廣泛存在于各種活的生物體中，活的菌體中也含有ATP。細菌死亡后，在細胞內酶的作用下，將很快被分解掉。ATP生物熒光檢測是基于生物發光體系的發光機理所設計，螢火蟲具有特殊的發光物質——蟲熒光素及熒光素酶，熒光素易被氧化，它在熒光素酶催化下，由ATP激活，使之與氧結合，熒光素分子中的電子躍遷到高能級，處于不穩定的激發態，當電子跳回到低能級時，即發出熒光光子。該光的強度與被檢測物質中所含的ATP量成正比，利用高靈敏度的儀器測定光的強度進行定量分析。因此，通過測定樣品中ATP的濃度，即可推算出活菌數。生物發光法的檢測步驟大體包括：棉拭取樣、樣品萃取、添加熒光素和熒光素酶混合物、測定生物發光量、做出標準曲線、求出濃度和活菌數。通常，細菌表層有細胞膜和細胞壁包裹，故樣品未經處理是不能測定的。測定時需先將樣品與微生物用提取試劑混合，使細胞膜和細胞壁開孔，提取出ATP提取試劑是以表面活性劑為基質的專用試劑。然后，再與熒光素和熒光素酶生物發光試劑作用，用熒光儀測定與發光試劑反應的生物發光量。

這種方法可自動化操作，靈敏度高，可以達到10-12 mol/L；檢測速度快，相比表面皿培養法，僅需十幾分鐘就可以完成一個樣本的檢測；檢測范圍廣，此種方法不僅可以檢測微生物，還可以對食品生產設備的清潔度、酵母菌，乳酸菌等菌種的發酵活性等進行檢測。沈陽中科靚馬生物工程有限公司從中科院遺傳與發育所引進了“含蟲光素基因的新型菌株及蟲光素酶的生產方法”發明ZL，成功研發了具有我國自主知識產權的“ATP熒光法細菌總數快速檢測系統”，系統采用了先進的ATP生物發光技術，只要測定出相對熒光值，依據相對熒光值與細菌總數的標準曲線，幾分鐘內即可快速得出樣品中的細菌總數。2008年周愛玉等對手持式ATP生物熒光檢測儀進行研制，取得了良好的結果。下圖即是兩款不同的類型，其中左側被稱之為掌上ATP發光法檢測儀，使檢測更加方便。

2.2 傳統菌落技術法

菌落總數的測定，一般將被檢樣品制成幾個不同的10倍遞增稀釋液，然后從每個稀釋液中分別取出1mL置于滅菌平皿中與營養瓊脂培養基混合，在一定溫度下，培養一定時間后（一般為48小時），記錄每個平皿中形成的菌落數量，依據稀釋倍數，計算出每克（或每ml）原始樣品中所含細菌菌落總數。
 

3、ATP生物發光技術的應用

ATP生物發光法的應用范圍十分廣泛，現已應用于食品行業的多個領域。研究表明，ATP生物發光法與標準的細菌培養菌落計數法相比，二者具有良好的相關性(r=0.98)，但怎樣細分細菌種類有一定的難度,還需要做大量的工作。利用這種方法可以對食品原料、肉類、水產品、蔬菜、飲料、酒類、酸奶等中微生物的含量進行定量。此外，采用ATP生物發光法可快速、簡便地檢測食品生產環境的清潔度。對ATP 含量的檢測是以相對發光值(Relative Light Unit ,簡稱RLU)表示的。隨著RLU值的降低，微生物的檢出幾率也降低。實驗證明：如果將RLU值以100～1000作為界限，RLU值不滿100時，微生物檢出幾率為0，RLU值在100～1000范圍內時，微生物檢出幾率為30%，RLU值超過1000時，微生物檢出幾率為96%。根據這一結果，在日常對食品生產設備或與食品密切接觸設備清潔度的檢測時，可以將RLU值不滿100時視為安全，RLU值在100～1000范圍內時視為要引以重視和注意，RLU值超過1000時視為處于微生物污染的危險狀態，因此ATP 生物發光法十分適HACCP系統的清潔度檢測。此外，還可以用于酵母菌等對毒素的敏感性比較。近年來，ATP生物發光技術在國內外倍受推崇，在美、日等國食品行業的質量檢測控制領域廣泛應用，有效促進食品生產企業提高生產效率和經濟效益，隨著此方法不斷改進和完善，生物發光法可望發展成為一種較為理想的微生物檢測方法而得到更廣泛的應用，以不斷提高產品質量，確保食品質量安全。