B淋巴細胞膜表面免疫的檢查

實驗概要

本實驗介紹了用直接免疫熒光法檢查B 淋巴細胞膜表面免疫球蛋白（SmIg）的基本原理和操作步驟。

實驗原理

SmIg 是B  細胞的抗原識別受體，也是B 細胞特異的表面標志，用直接免疫熒光法可檢查出SmIg。用熒光素標記的抗Ig  抗體，在一定條件下與淋巴細胞混合，熒光素標記的抗Ig 抗體可以與B 細胞表面的Ig 結合，在熒光顯微鏡下觀察可見B  細胞膜上出現熒光。此方法可用來鑒定B 淋巴細胞。

主要試劑

1. 異硫氰酸熒光素（FITC）標記的兔抗小鼠Ig 抗體（購自BD 公司）
2. Hank's液：pH7.4(內含0.1%NaN₃)

主要設備

1. 臺式離心機
2. 離心管

3. 吸管

4. 移液管等

實驗材料

ICR 小鼠

實驗步驟

1.  采用頸椎脫臼法處死小鼠，解剖取出脾臟放入盛有6ml Hank's液的平皿中，用100  目鋼網研磨，混勻。從中吸取1ml細胞懸液放入一試管中，加滿Hank's液，離心1000rpm，10  分鐘，洗滌細胞一遍。傾去上清，沉積的細胞恢復1ml容積，即為約1×10⁷/ml的細胞懸液。另取一支試管，吸取1×10⁷/ml的細胞懸液0.4ml加Hank's液3.6ml，即為1×10⁶/ml的細胞懸液。
2. 取2ml離心管兩只，各加入1×10⁶/ml的細胞懸液1ml，用臺式離心機離心2000rpm，3 分鐘，棄去上清液。一支加入熒光素標記的兔抗鼠Ig抗體100μl，另一支不加抗體作對照，置4℃冰箱30 分鐘。
3. 取出離心管，用Hank's 液洗滌細胞兩次，以去除游離的抗體，最后一次離心后棄去上清液，留少許回流液，混勻，滴片，用熒光顯微鏡觀察。
4. 實驗結果
熒光顯微鏡觀察，落射激發光下SmIg 陽性細胞可見環狀或斑點狀熒光。用鎢絲燈光源透射光照明計數同一視野內淋巴細胞總數，共計數200～300 個淋巴細胞，算出其中SmIg 陽性細胞的百分數。

注意事項

在滴片前要徹底去除游離的抗體，以避免假陽性結果。