包括48 個擴增反應所需的試劑
請在使用前通讀操作說明書
1. 試劑盒組成
? 25 管 擴增反應試劑球 (Reagent Sphere； 4oC 保存)
? 2 x 520 μl FMDVA-1 擴增反應試劑球溶液 (Sphere Diluent； -20oC 保存)
? 2 x 25 μl 陽性對照 (Positive control； -20oC 保存)
? 1 x 10μl Taq酶(Taq Polymerase； -20oC 保存)
保存條件
試劑球需置干燥劑中保存在4oC，已融解的試劑球則需保存在零下20oC。其他試劑需保存在零下20oC。使用前在冰上溶解各試劑并充分混合，不要旋渦振蕩含酶的擴增反應試劑。
2. 操作程序
擴增反應試劑的準備
1. 計算所需的反應數量 (n)
2. 需要溶解的試劑球 = 0.5 x n
3. 每個試劑球需要 40 μl 試劑球溶液及0.4μl Taq酶。
4. 在冰上溶解試劑，并輕輕扣擊充分混合 (不要旋渦振蕩含酶的試劑)
反應的準備
1. 實驗中除從樣本中獲得的RNA 模板外，我們還建議設置陽性和陰性（水）對照
2. 按照下表準備擴增反應試劑：
反應組分
每個反應體積
擴增反應試劑
20 μl
樣品RNA
5 μl
總體積
25 μl
注意:
? 實驗時 RNA 應放在冰上
? 陽性對照建議加5 μl 試劑盒提供的陽性對照。
? 建議PCR 過程中檢測樣本設置重復，以便得到可靠的實驗結果
? 為了驗證陰性實驗結果不是由于樣本中存有PCR 抑制物而導致PCR 呈陰性反應，我們建議在測試樣本中加1 μl 的陽性對照作為spiking 對照 (spiking control)，同時進行PCR 反應。
PCR 循環:
數據收集位點（FAM染料）
ABI7700 ABI7300 其它儀器
1 個循環 42oC 30 分鐘 *
95oC 10 分鐘 *
5 個循環 95oC 10 秒 *
45oC 30 秒 *
72oC 60 秒 *
40 個循環 95oC 15 秒 *
58oC 60 秒 * * *
( * 表示位點收集FAM讀數)
3. 實驗數據分析
陰性的實驗結果有幾個可能性：
1. 樣本中不存在目的片段；
2. 樣本中目的片段的量低于檢測值；
3. 樣本中存有 PCR 抑制物。
試劑盒中設計spiking 對照 (spiking control) 是為了確定沒有發生PCR 抑制。
如果樣本中加了陽性對照以后擴增結果的Ct值接近40（或者接近陰性對照的Ct值），說明樣本中存在PCR 抑制物，那幺此次陰性的實驗結果就不能作為正確的結果，需要重新開始樣本核酸的提取和PCR 擴增。
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