BIOXL豬口蹄疫亞O型一步法熒光RTPCR診斷試劑盒說明書

包括48 個擴增反應所需的試劑

請在使用前通讀操作說明書

1. 試劑盒組成

? 25 管 擴增反應試劑球 (Reagent Sphere; 4oC 保存)

? 2 x 520 μl FMDVA-1 擴增反應試劑球溶液 (Sphere Diluent; -20oC 保存)

? 2 x 25 μl 陽性對照 (Positive control; -20oC 保存)

? 1 x 10μl Taq酶(Taq Polymerase; -20oC 保存)

保存條件

試劑球需置干燥劑中保存在4oC，已融解的試劑球則需保存在零下20oC。其他試劑需保存在零下20oC。使用前在冰上溶解各試劑并充分混合，不要旋渦振蕩含酶的擴增反應試劑。

2. 操作程序

擴增反應試劑的準備

1. 計算所需的反應數量 (n)

2. 需要溶解的試劑球 = 0.5 x n

3. 每個試劑球需要 40 μl 試劑球溶液及0.4μl Taq酶。

4. 在冰上溶解試劑，并輕輕扣擊充分混合 (不要旋渦振蕩含酶的試劑)

反應的準備

1. 實驗中除從樣本中獲得的RNA 模板外，我們還建議設置陽性和陰性（水）對照

2. 按照下表準備擴增反應試劑：

注意:

? 實驗時 RNA 應放在冰上

? 陽性對照建議加5 μl 試劑盒提供的陽性對照。

? 建議PCR 過程中檢測樣本設置重復，以便得到可靠的實驗結果

? 為了驗證陰性實驗結果不是由于樣本中存有PCR 抑制物而導致PCR 呈陰性反應，我們建議在測試樣本中加1 μl 的陽性對照作為spiking 對照 (spiking control)，同時進行PCR 反應。

PCR 循環:

                                                       ( * 表示位點收集FAM讀數)

3. 實驗數據分析

陰性的實驗結果有幾個可能性：

1. 樣本中不存在目的片段；

2. 樣本中目的片段的量低于檢測值；

3. 樣本中存有 PCR 抑制物。

試劑盒中設計spiking 對照 (spiking control) 是為了確定沒有發生PCR 抑制。

如果樣本中加了陽性對照以后擴增結果的Ct值接近40（或者接近陰性對照的Ct值），說明樣本中存在PCR 抑制物，那幺此次陰性的實驗結果就不能作為正確的結果，需要重新開始樣本核酸的提取和PCR 擴增。