C3b致敏酵母菌凝集試驗測定法

實驗概要

酵母菌經煮沸后，酵母多糖粘固在菌壁表面，可激活并粘附血清中的C3b，形成C3b致敏酵母菌，它能與免疫復合物中IgG上的補體結合點結合，如再加抗IgG，即能使致敏的酵母菌凝集。

主要試劑

1. 生理鹽水、鮮酵母塊、小鼠血清、10%明膠液、CFD原液、抗IgG血清、凝聚IgG、正常IgG等。

2. 0.1%明膠緩沖液：CFD原液用雙餾水稀釋5倍，即成應用液，取其99ml加10%明膠懸液1ml，即為0.1%明膠緩沖液。

主要設備

10ml試管、10ml離心管、滴管、1ml吸管或定量加樣器、輸液滴管、5號針頭、玻璃濾斗、定性濾紙、水平離心機、水浴箱等。

實驗步驟

1. 1%酵母菌的制備：取市售鮮酵母少許，用生理鹽水配制成約1%～2%，洗滌3次，恢復原體積，置沸水浴中30min，用定性濾紙過濾，除去酵母凝塊(低倍鏡觀察如仍有凝塊，應再過濾)。取分散酵母菌，用生理鹽水洗滌2次，最后用GVB液洗1次(此次應置刻度離心管內洗)，2500 r/min離心15min，去上清液，用GVB液配成1%酵母菌懸液(相當于1×10⁸菌/ml濃度)。

2. 小鼠血清的分離：試驗當天對小鼠剪眼球采血液，放37℃水浴15min，離心分離血清，供作補體用。

3. C3b致敏酵母菌使用液的制備：取1%酵母菌懸液少許，加等量小鼠血清混勻。置37℃水浴箱15min，用5～10ml GVB液洗1次，2500 r/min水平離心10min，去上清液即得C3b致敏酵母菌，用GVB液恢復原體積，菌數應為1×10⁸個菌/ml，再5倍稀釋成2×10⁷個菌/ml的使用懸液。

4. 測定：取試管5支，第1管用定量加樣器加GVB液0.7ml，第2管不加GVB液，第3管至第5管各加GVB液0.1ml。第1管為稀釋管加被檢血清0.1ml，混勻，取0.1ml移至第2管(濃度為1：8)，另取0.1ml移至第3管(濃度為1：16)，依次作對倍稀釋，第5管混合后棄去0.1ml。然后用裝配5號針頭的輸液滴管吸取C3b致敏酵母菌使用液，給2～5管各加5滴，充分混勻，放37℃水浴30min。取出后每管加GVB液5～7ml，混勻，2 000 r/min離心5min，棄去上清液，用濾紙吸干。加入用GVB液作1：20稀釋的抗IgG抗體(效價1：80)0.1ml，充分混勻，放4℃冰箱2h后，取出輕輕搖勻，吸取懸液少許置玻片上，低倍鏡下觀察(光線不可過強)，每次試驗設凝聚IgG陽性對照與GVB液陰性對照。

5. 結果判定

-酵母菌散在；

25%以下酵母菌凝集成小塊；

25%～50%酵母菌凝集成中等大絮狀凝塊；

50%～75%酵母菌凝集成較大絮狀凝塊；

75%~100%酵母菌凝集成大絮狀凝塊。

若陰性對照管為陰性，測定管1∶8或以上出現＋＋，即可判定為陽性。