1、簡介
DRG CA72-4 ELISA試劑提供的材料用于在人體血清或血漿中定量檢測腫瘤相關抗原CA72-4 (TAG-72)。本實驗僅供體外診斷使用。
CA72-4(癌抗原72-4)最初被描述為由B72.3識別的抗原因子。B72.3是由相應的原發腫瘤轉移后的膜萃取物免疫雜交生產的鼠單克隆抗體。CA72-4被證實是1MDa的粘液樣糖蛋白，合成物稱為TAG72（腫瘤相關抗原72）。TAG72蛋白的分子量為48KD. 血清和血漿中的CA72-4的水平升高見于某些惡性疾病，包括胰、胃、膽、結腸、乳腺、卵巢、子宮頸、子宮內膜的腫瘤。它對胃腸道和卵巢的腫瘤有很高的診斷學的敏感性。盡管在一些良性的疾病如風濕病和卵巢囊腫也發現有CA72-4的升高，但是臨床研究表明，對于胃腸道和卵巢腫瘤，特異性診斷高達95％。CA72-4的水平和腫瘤的大小及分級緊密關聯。CA72-4是胃腸道腫瘤的病人選擇治療學的監測和隨后的護理的指標。另外合適的指標是CA199和CEA，另外，CA72-4是卵巢腫瘤的病人選擇治療學的監測和隨后的護理的可靠性指標，尤其是對于CA125陰性的病人。
2、實驗原理
DRG公司的CA72-4酶免實驗是一種基于夾心法原理的固相酶免吸附實驗（ELISA）。反應板上的微檢測孔包被有能結合CA72-4分子上獨特抗原位點的單克隆小鼠抗體。一份含有內源性CA72-4的病人樣本在包被孔中與酶聯物進行孵育，該酶聯物是一種聯結有辣根過氧化物酶的抗CA72-4抗血清。孵育后，用洗滌液洗去未結合的酶聯物。結合上的辣根過氧化物酶的總量與樣本中CA72-4的濃度成正相關。加入底物溶液后，顯出的顏色強度與病人樣品中CA72-4的濃度成正比。
3、試劑盒成分
1）微孔板：12x8孔，可拆，微孔中包被抗CA72-4 單克隆抗體。
2）標準品（標準品0-4）：5支 0.5ml，即用，濃度為0,3，20，50，100U/ml，內含無水銀防腐劑。
3）質控高&低：2支 凍干粉，0.5ml，見“試劑準備”，質控品的濃度及范圍請見試劑瓶標簽或質控單。內含無水銀防腐劑。
4）樣品稀釋液：一支，3ml，即用，內含無水銀防腐劑。
5）酶聯物：1支 14ml，標記辣根過氧化物酶的抗CA72-4抗體，內含無水銀防腐劑。
6）TMB底物液：一支 14ml，即用。
7）終止液：0.5M的硫酸，一支 14ml，即用，避免接觸終止液，以免刺激或著燒皮膚。
8）洗滌液（40X）：一支 30ml.
注意：用于樣品稀釋的樣品稀釋液應視需要而定。
4、實驗需要器材（但試劑盒不提供）
1) 酶標儀(450±10nm)。
2) 移液器
3) 吸水紙
4) 蒸餾水
5) 計時器
6) 坐標紙或是數據處理軟件
5、試劑的儲存與穩定性
未開啟的試劑在2-8℃下儲存，在保質期內保持其穩定性。不要使用過期的試劑。所有開啟了的試劑都應在2-8℃下儲存，微孔板需在2-8℃下儲存，一旦打開了微孔板的袋子，需小心地將其重新密封。
6、試劑的準備：
在使用前將所有的試劑和所需的板條平衡至室溫。
質控品：在凍干粉中加入0.5ml的蒸餾水使其復溶，并至少放置10min，在使用前充分搖勻。復溶后的質控品需在-20℃下儲存。
洗滌液：在30ml濃縮的洗滌液中加入1170ml的蒸餾水，最終洗滌液的容積為1200ml。稀釋后的洗滌液在室溫下兩星期內保持穩定。
7、樣品的采集與存儲
本實驗可使用血清或血漿（使用EDTA或肝素抗凝）樣品，不要使用溶血﹑脂血﹑黃疸的樣品。注意：含疊氮鈉的樣品不能用于此實驗。
7.1樣品采集
血清：靜脈采血，允許使用凝血，在室溫下用離心法分離血清。全血未完全凝固前請勿離心，接受了抗凝劑治療的病人血液可能需要更長的凝血時間。
血漿：將全血收集到含有抗凝劑的離心管內，收集后馬上用離心法分離。
7.2樣品的儲存
樣品蓋好蓋子后，可在實驗前2-8℃下儲存5天，要更長時間儲存，應在-20℃下凍存。在開始實驗前應避免反復凍融樣品。
7.3樣品的稀釋
在最初的實驗中，要是樣品的濃度高于最高標準品，則樣品應用按實驗步驟所描述的10倍或100
倍稀釋。在計算濃度時需乘以此稀釋系數。
例子：
a） 按1：10稀釋： 10ul的血清+90ul的樣品稀釋液（充分搖勻）。
b） 按1：100釋稀：10ul按a）稀釋的血清+90ul的樣品釋稀液（充分搖勻）
8、實驗步驟
8.1總論
1）在使用前所有試劑和樣品均需平衡至室溫，所有試劑要充分混合但不要起泡。
2）一旦實驗開始，所有步驟都必須進行到底而不能中斷。
3）對每種試劑﹑標準品和樣品使用一次性的吸嘴，以避免交叉污染。
4）吸光率決定于溫育時間和溫度，在開始實驗前，建議準備好所有的試劑，將需要檢測的微孔板固定在板架上，這些步驟保證每次加液步驟所需時間相同而沒有中斷。
5）按照一般的規律，酶反應時間與溫育時間和溫度成線性比例。
8.2操作步驟
每次實驗都應含有一條標準曲線
1）將實驗所需數目的板條固定在板架上。
2）用一次性吸嘴將20ul的標準品﹑質控品和樣品加入相應的檢測孔中。
3）每孔加入100ul的酶聯物。
4）徹底混合十秒，在此步驟里，充分搖勻十分重要。
5）不用封板，在室溫下溫育120分鐘。
6）快速棄去檢測孔中的內含物，每孔用400ul洗滌液洗板五次，在吸水紙上用力拍板以除去殘留的液體。注意：洗板步驟是否正確將直接影響到實驗的靈敏度和精確性。
7）每孔加入100ul的底物液。
8）在室溫下溫育30分鐘。
9）每孔加入100ul的終止液終止反應。
10） 在加終止液后十分鐘內，室溫下，于450nm處讀取吸光率。
9、結果計算
1）計算標準品﹑質控品和病人樣品的平均吸光率。
2）以吸光率為Y軸，濃度為X軸，按照從標準品中獲得的平均吸光率和其相對應的濃度值，繪制標準曲線。
3）利用樣品的平均吸光率，在標準曲線上得出其相應的濃度值。
4）自動方法：使用立方函數﹑四參數模式或雙對數的計算機程序可得到結果。
5）樣品的濃度可從標準曲線上直接獲取。樣品的濃度高于最高標準品的濃度則需進一步稀釋。在計算樣品的濃度的時候，要乘以稀釋倍數。
下面是CA72-4 ELISA的標準曲線的典型例子。
標準品 | 吸光率（450nm） |
零標準品（0 U/ml） | 0.08 |
標準品1（3U/ml） | 0.19 |
標準品2（20 U/ml） | 0.59 |
標準品3（50 U/ml） | 1.16 |
標準品4（100 U/ml） | 2.02 |
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準！