CASMS分論壇：相互作用組學和結構蛋白質組學前沿

  分析測試百科網訊 美國東部時間2021年8月9日-13日，首屆美國華人質譜學會（CASMS）學術研討會暨展覽會在Gather.Town隆重舉行。8月11日的“Frontiers in Interactomics and Structural Proteomics” （相互作用組學和結構蛋白質組學前沿進展）分論壇由加利福尼亞大學爾灣分校HuangLan（黃嵐）教授主持。來自荷蘭烏特列支大學的Albert Heck博士、北京生命科學研究所的董夢秋研究員、美國匹茲堡大學醫學院的Yi shi博士、美國華盛頓特區喬治華盛頓大學化學系的Ling Hao博士、美國佐治亞理工學院化學與生物化學學院的Ronghu Wu 博士、美國加利福尼亞大學爾灣分校生理學與生物物理學系的黃嵐教授分別做精彩報告。分析測試百科網作為大會支持媒體，為您帶來全程跟蹤報道。 

荷蘭烏特列支大學生物分子質譜和蛋白質組學部門Albert Heck博士

報告題目：Higher Order Organization of the Plasma Proteome

  Albert Heck博士首先介紹了血漿蛋白質組的研究方法，其關于COVID-19的最新研究成果發表在Life Science Alliance上。血漿中的很多蛋白是糖蛋白研究組用Native MS（非變性質譜） Orbitrap技術來分析糖型，并舉例了人促紅細胞生成素的非變性質譜分析。課題組結合非變性質譜和Middle-Down的一體化蛋白質組學方法來分析糖蛋白，即用非變性質譜分析糖型，并酶解后用Middle-Down組學方法來定量特定位點的PTM（翻譯后修飾），后者重組后的數據和前者非常吻合。

Fetuin是一種研究敗血癥有意義的血漿蛋白，課題組進樣100uL血漿用離子交換色譜分離，截取出有效的胎球蛋白（fetuin）餾分再進行分析。課題組分析了20個有獨特糖型志愿者的血漿后，研究其糖型特點；研究了血漿蛋白質組的高階結構：結合珠蛋白（haptoglobin），用非變性質譜和top-down策略研究了源自不同基因型的haptoglobin的四階結構、糖基化和血紅蛋白結合特性。課題組還使用交聯質譜技術并研發了PhoX簡便快速的富集技術，并介紹了膠上交聯（IGX-MS）技術，研究了膜攻擊復合物的組裝體（MAC），用交聯質譜和冷凍電鏡觀察研究了各種sMAC結構。

北京生命科學研究所 董夢秋研究員

報告題目：Ten Seconds of Lysine-Lysine Cross-linking under Denaturing Conditions Using di-ortho-phthalaldehyde (DOPA) Enables Mass Spectrometry Analysis of Protein Unfolding

  董夢秋博士首先表示，今年AlphaFold 2和RoseTTAFold人工智能在預測蛋白結構方面的新聞振奮人心，結構生物學從“快照”走向“電影”，不再僅研究靜態的結構，而可以研究動力學和構象變化，這些對于結構蛋白質組學來說充滿機遇和挑戰。她接下來簡介了交聯質譜技術（CXMS/XLMS/CL-MS），但過去僅限于研究靜態結構，因為構象變化太快，交聯反應太慢，比如使用NHS ester交聯劑的交聯反應常為數十分鐘到2小時。課題組研究了一種新型僅需10秒鐘的交聯反應，使用DOPA2交聯劑，快速的非水解型K-K交聯劑。文獻最早報道的OPA（鄰苯二甲醛）已比NHS ester快3-7倍，課題組進一步研發了DOPA2，在SDS-PAGE上交聯僅需10秒（比DSS快60-120倍），在酶解后的LCMS分析中僅需10-20秒，用FRET（熒光共振能量轉移）方法也觀察到10-20秒的交聯時間。研究還發現，DOPA2的交聯可發生在變性劑存在情況下。接下里舉例介紹了SNase（葡萄球菌核酸酶）的交聯質譜分析，在尿中SNase有兩種過渡態，用DOPA2交聯了兩種SNase過渡態并觀測了各自結構，并發現了新的loop連接。在尿中RNase A的交聯質譜分析中，在不同時間點、不同濃度下取出樣品，可觀測到有趣的不同結果，并可進行分子動力學模擬RNase A的各種非折疊中間體。DOPA2可在10秒交聯，可耐受尿液和GdnHCL，雖然對于“錄像”更多構象還不夠快，但已經邁出了重要一步。 

美國匹茲堡大學醫學院，Yi shi（時毅）博士

報告題目：Proteomics Facilitates the Development of A Novel Inhalation Therapy for the Evolving COVID-19 Pandemic（蛋白質組學有助于發展新的吸入療法，以應對不斷演變的新冠病毒-19大流行）

  Yi shi博士介紹了納米抗體（Camelid Nanobodies，Nb）的特點，分子量小（約15000 Da）非常穩定可溶性高，低成本快速生產，易于生物工程，在可吸入方面有潛力，生物安全性高；其高通量、高質量、穩定和快速的特性非常吸引人。Yi Shi博士進一步介紹了其表征方法，特性并分析了其機理。在過去的一年里，時毅教授的研究團隊與合作者通過給大羊駝免疫，并結合先進的蛋白質組學平臺技術，快速鑒定了超過8000個納米抗體，可以強效結合新冠病毒受體結合域（RBD）。這些高親和的納米抗體水溶性好，穩定性高，適合低成本快速生產。穩定的納米抗體可以通過氣化噴霧吸入，用于治療病毒引起的肺部感染。在倉鼠模型中，研究團隊首次證明了可吸入納米抗體的高效率，只需超低劑量（0.2mg/kg）吸入，就可在動物感染新冠病毒后迅速起到保護作用，將肺內病毒顆粒數量降低為百萬分之一。總結來看，該研究為Nb藥物發現建立強大蛋白質組學通路，發現了高效中和病毒的納米抗體，多價結構的生物工程提高效力<0.1ng/mL，使用穩定的霧化Nb進行高效吸入治療，結構研究揭示了三類中和Nbs，并提供了潛在抗病毒藥物的見解機制，兩類對揮發性有機化合物具有高度抗性，使用Nb雞尾酒療法可最大限度地減少突變逃逸。

美國華盛頓特區喬治華盛頓大學化學系，Ling Hao博士

報告題目：Developing Proximity Labeling Proteomics Strategies for Neurodegenerative Diseases（神經退行性疾病鄰近標記蛋白質組學研究進展）

  Ling Hao博士介紹了課題組發展的基于質譜的技術，開展鄰近標記蛋白質組學技術，介紹了其技術挑戰，討論了可裂解生物素化。在神經退行性疾病研究方面，研究了溶酶體功能障礙，線粒體功能障礙等。蛋白-蛋白的相互作用可分為穩態作用，瞬態作用，和鄰近蛋白質。鄰近標記（PL）技術使用PL酶，捕獲穩態、瞬態蛋白相互作用和分子的微環境。課題組發展了Lysosomal PL（溶酶體鄰近標記）蛋白質組學技術，觀察蛋白的相互作用。PL-MS存在的技術挑戰包括：高豐度內源性生物素化蛋白質，實驗條件變化，鏈霉親和素污染，缺乏生物素化位點信息等，課題組發展了各種方法來應對上述挑戰。

美國佐治亞理工學院化學與生物化學學院，Ronghu Wu 博士

報告題目：Effective Mass Spectrometry-Based Methods to Globally Analyze Glycoproteins on the Cell Surface and Their Interactions（基于質譜的有效方法全面分析細胞表面的糖蛋白及其相互作用）

  Wu博士首先簡介了研究細胞表面糖蛋白的重要性。課題組發展了有效的基于質譜的技術來靶向分析細胞表面糖蛋白。研究不同類型的人類細胞后發現，表面糖蛋白獨特和差異的表達決定了細胞類型，因此課題組研究其動力學，對細胞免疫應答不同期間細胞表面糖蛋白進行定量來研究動力學。用LPS處理后，進行時間分辨的定量，研究并比較了單核細胞、巨噬細胞的表面糖蛋白定量動力學，比較分析了其主要差異和特異的位點變化，在用交聯選擇性富集后分析表面糖蛋白的相互作用，并構建了細胞表面蛋白質相互作用組，對交聯肽的鑒定揭示出表面直接的相互作用。總體而言，課題組發展了集代謝標記，生物正交化學和基于質譜的蛋白質組學技術來特異地分析細胞表面的糖蛋白，對病毒感染的細胞表面糖蛋白的動力學進行定量，鑒定了IGSF8和TSPAN3等新的表面糖蛋白并揭示其糖基化位點的變化；通過綜合利用化學交聯、選擇性富集和蛋白質組學技術，全局性分析了表面糖蛋白的相互作用，鑒定了表面蛋白的直接作用。

美國加利福尼亞大學爾灣分校生理學與生物物理學系，黃嵐教授

報告題目：Developing Cross-linking Mass Spectrometry to Define Interaction and Structural Topologies of Protein Complexes（發展交聯質譜以確定蛋白質復合物的相互作用和結構拓撲）

  黃嵐教授首先簡介了XL-MS（交聯質譜）分析方法，課題組發展了DSSO（Disuccinimidyl Sulfoxide）交聯劑，并介紹其在一級質譜、二級質譜、三級質譜的表現，通過MSⁿ技術可非混淆地準確鑒定DSSO內交聯的肽段。課題組還發展了一系列如DHSO、BMSO等交聯劑，并已同Sigma、賽默飛、Cayman等建立了商業合作。黃教授繼續介紹了包含亞砜的質譜交聯劑的交聯質譜分析策略，如PPI Mapping，分析構象變化、結構模型等，比較了DSSO、DHSO、BMSO交聯距離的尺寸變化，因此可應用多種交聯劑的策略來分析蛋白質復合物的綜合結構模型，介紹了其在活體PPI研究中的成功應用。隨后黃教授介紹了具有雜化雙功能光反應的含亞砜交聯劑來研究蛋白復合物，在基于SDADO的交聯質譜分析策略方面，課題組分析了26S 蛋白酶體原子模型，用XL-PPI研究26S 蛋白酶體的網絡拓撲結構，被雙吖丙啶（Diazirine）靶向的氨基酸分布。

  總體而言，課題組發展了一系列含有亞砜的質譜裂解交聯劑，在蛋白復合物的結構分析中可快速準確鑒定交聯多肽，基于SDASO的交聯多級質譜工作流程，可以對大蛋白復合物進行光活化交聯質譜分析，比較而言，SDASO交聯劑穩定，并捕獲與殘基特異性試劑互補的相互作用。

  關于Frontiers in Interactomics and Structural Proteomics分論壇演講人的簡介，請見：http://www.casms.org/?action=content&id=61