原理：變性梯度凝膠電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophresis，DGGE）是一種實用價值較高研究DNA突變的分析方法。本質是一類電泳（電泳定義：帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳(electrophoresis, EP)。利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達到分離的技術稱為電泳技術。）
DGGE主要是利用梯度變性膠來分離DNA片段。當電泳開始時，DNA在膠中的遷移率僅與分子大小有關，一旦DNA移動到某一點，達到該DNA變性濃度位置時， DNA雙鏈開始分開，從而降低了DNA的遷移速率。由于不同的DNA片段具有的堿基組成不同，使得變性條件產生差異，在凝膠上形成不同的條帶，從而可以區分DNA突變型和野生型，可以進一步進行基因突變的分析。
另外DGGE還可與PCR聯合使用，利用此項技術可以準確鑒定出單堿基替換、移框突變和少于10個堿基的缺失突變。通常先用病人的基因組DNA或者是有突變個體的DNA進行PCR擴增，然后用DGGE進行分析。最早由DGGE篩查的人類基因是珠蛋白位點，以后又有很多位點被篩查，如生長因子Ⅷ基因、生長因子Ⅸ基因等。并且該法適用于大樣本的篩查，對一些罕見突變型的篩查也十分有用。
PCR-DGGE的另一個作用是可分析突變組成即突變譜。主要是利用誘變劑體外誘變人類原始淋巴細胞株，使之生成大量的HPRT-突變體，然后進行PCR擴增，用DGGE分析。用定量PCR-DGGE方法還可以確定標本中某特異DNA序列的拷貝數。其原理是將已知拷貝數的內參照與標本中的靶基因共同擴增，然后DGGE分離兩者的擴增產物，根據其比率可以確定標本中靶基因的拷貝數。
步驟：
一、制變性膠：梯度膠制膠生成器來制作變性膠。
1.配制溶液（試劑準備）：
1. 40% Acrylamide/Bis(37.5:1)
Reagent
Amount
Acrylamide
38.93g
Bis-acrylamide
1.07g
dH2O
To 100.0 ml
2. 50× TAE Buffer
Reagent
Amount
Final Concentration
Tris base
242.0g
2 M
Acetic acid, glacial
57.1 ml
1 M
0.5 M EDTA, pH 8.0
100.0 ml
50 mM
dH2O
To 1,000.0 ml
Mix. Autoclave for 20-30 minutes. Store at room temperature.
3. 0% Denaturing Solution
6% Gel
8% Gel
10% Gel
12% Gel
40% Acrylamide/Bis
15ml
20ml
25 ml
30 ml
50×TAE Buffer
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
dH2O
83 ml
78 ml
73 ml
68 ml
Total volume
100 ml
100 ml
100 ml
100 ml
Degas for 10-15 minutes. Filter through a 0.45 u filter. Store at 4 ℃ in a brown bottle for approximately 1 month.
100% Denaturing Solution
6% Gel
8% Gel
10% Gel
12% Gel
40% Acrylamide/Bis
15 ml
20 ml
25 ml
30 ml
50×TAE Buffer
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
Formamide(deionized)
40 ml
40 ml
40 ml
40 ml
Urea
42 g
42 g
42 g
42 g
dH2O
To 100 ml
To 100 ml
To 100 ml
To 100 ml
Degas for 10-15 minutes. Filter through a 0.45 u filter. Store at 4 ℃ in a brown bottle for approximately 1 month. A 100% denaturant solution requires re-dissolving after storage. Place the bottle in a warm bath and stir for faster results.
4. For denaturing solutions less than 100%, use the volumes for acrylamide, TAE and water described above in the 100% Denaturing Solution. Use the amounts indicated below for urea and formamide
Denaturing Solution
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
Formamide(ml)
4
8
12
16
20
24
28
32
36
Urea(g)
4.2
8.4
12.6
16.8
21
25.2
29.4
33.6
37.8
5. 10% Ammonium Persulfate
Reagent
Amount
Ammonium persulfate
0.1 g
dH2O
1.0 ml
Store at –20 ℃ for about a week.
6. 2× Gel Loading Dye
Reagent
Amount
Final Concentration
2% Bromophenol blue
0.25 ml
0.05%
2% Xylene cyanol
0.25 ml
0.05%
100% Glycerol
7.0 ml
70%
dH2O
2.5 ml
Total volume
10.0 ml
Store at room temperature.
7. 1× TAE Running Buffer
Reagent
Amount
50× TAE buffer
140 ml
dH2O
6,860 ml
Total volume
7,000 ml
Denaturing gel
Gel
8.
Reagent
Volume
Reagent
Volume
0%UF
具體根據需要的變性范圍按比例計算，共12.5 ml
ddH2O
3.9ml
100%UF
50× TAE
100 uL
APS
25 uL
40% Acrylamide
1 mL
TEMED
15 uL
APS
10 uL
配制一個高濃度，一個低濃度，體積各12.5 mL，操作要迅速，配制時抽氣和冰浴的必要性不大
TEMED
8 uL
現用現配
2.灌膠：
各取高低濃度兩種變性劑12.5 mL，分別加入兩個梯度生成器兩個管槽中，高濃度加入右側管槽，低濃度加入左側管槽，再加入交聯劑（先加APS，再加TEMED）。利用蠕動泵將溶液灌至凝膠盒里兩塊玻璃板之間，待溶液充滿玻璃板后插入梳子，放置一段時間等溶液凝固成膠體。
二、跑電泳：DNA樣品在變性膠體中移動
1.將足量的緩沖液加入至槽體內，預熱到指定溫度。
2.將凝固好的凝膠盒放入槽體內，開始點樣，設定好電泳儀，進行跑電泳。
注意事項：
1.配置試劑時一定要用去離子水，制膠洗膜時用的各個容器也要用去離子水洗滌干凈，以防止氯離子污染。
2.制膠是實驗的關鍵。在往玻璃板中灌膠時，要利用好蠕動泵，將凝膠液勻速地灌入玻璃板。
3.灌完膠后，立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。
4.DGGE 的電泳緩沖液要超過“RUN”刻度線，不要超過“Maximam”刻度線。
5.點樣時，要用小型注射器，伸入點樣孔底部點樣。
6.每次用完儀器后要及時清理，清洗玻璃板培養皿等玻璃儀器。
結合以下配置對應圖，了解以下配置的功能：
1.槽體是用來加入緩沖液，提供電泳的環境。
2.電泳儀是用來給電泳供電，設置時間。
3.凝膠盒是用來固定玻璃板，一塊放入槽體內。
4.安全蓋可用戶自動斷電保護。
5.加熱器/攪拌器/緩沖液循環器是用來加熱控制溫度，保持溫度的均一性。
6.玻璃板，封邊膠條，封邊墊條，彈簧夾，蠕動泵以及梯度生成器一并組成灌膠裝置。
7.梳子插入到灌好的膠上層待其凝固后拔出，可產生點樣口。
8.虹吸泵可輕松將槽體內的緩沖液排出吸進。
9.溫度計用來校準溫度。
CBS DGGE配置對應圖解:
標配：2-Place DGGE System (DGGEK-2001-220)
1. 1 reinforced buffer tank/lower reservoir with platinum electrodes and attached anode power lead 槽體
2. EPS-300-II Power Supply (see page 26) 電泳儀
3. 2 single gel cassette/upper reservoir with platinum electrodes 兩個單面凝膠盒
4. Glass safety cover with electrical interlock 帶電子安全鎖的安全蓋
5. Heater/Stirrer/Buffer Cycler: Heating element and thermostat maintain excellent temperature stability (±0.2°) and minimize thermal stratification during DGGE.Buffer Cycler eliminates need of an external peristaltic pump to recycle buffer 加熱器/攪拌器/緩沖液循環器
6. 4 sets of spacers (2 sets for vertical DGGE and 2 sets with injection ports for perpendicular DGGE gel casting) 封邊墊條
7. 4 combs (2 each 1-well combs and 2 each 16-rectangular well combs) 電泳梳
8. Buffer siphon pump 虹吸泵
9. 2 sets of glass plates 玻璃板
10. MPP-100 Mini-peristaltic pump for gradient gel formation 梯度膠制膠時用的蠕動泵
11. GM-40 Gradient maker, 20mls per side 梯度膠制膠生成器
12. 4 Gel Wrap? gaskets 封邊膠條
13. White spring clamps 彈簧夾
14. Thermometer 溫度計