【細胞制備】
1．外周血單個核細胞的采集
1.1 用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞50-100mL；
1.2 淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞(PBMC)；
1.3 無血清培養液洗滌2次，獲得純度在90%以上的PBMC。
2．CIK細胞的培養及鑒定
2.1 將PBMC按1-2x 106/ml的濃度懸浮于無血清培養液中，加入1,000 U/ml的重組人IFN-γ，37oC，5%CO2培養箱中培養；
2.2 24h后加入50ng/ml的CD3單克隆抗體和300 U/ml的重組人IL-2，刺激CIK細胞的生長和增殖；
注：此時也可同時加入100 U/ml的重組人IL-1α。
2.3每3天半量換液或擴瓶一次，并補加重組人IL-2 300 U/ml；
2.4在培養的第14d，收獲CIK細胞。
2.5 CIK細胞質控：
2.5.1 臺盼藍染色檢測：活細胞應在80%以上；
2.5.2 流式細胞儀檢測細胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表達：CD3+CD56+細胞的比例應在20%以上。
2.5.3
細胞殺傷實驗：以CIK細胞為效應細胞，以腫瘤細胞(可為原代腫瘤細胞或腫瘤細胞株)為靶細胞，將效應細胞與靶細胞按10:1(數目比)的比例加入96孔U型板中，每孔含靶細胞1
x 104個，終體積為200μl，設3個復孔。培養4h，然后取培養上清，用乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒檢測效應細胞對靶細胞的殺傷率。
2.5.4收獲細胞前，取少量培養物進行細菌、真菌培養，并檢測支原體、衣原體，及內毒素(標準：病原學檢測陰性，內毒素<5 Eu)。
【步驟簡圖】
生產商 產品名稱 產品編號 產品規格 使用濃度
eBioscience Anti-Human CD3 Functional Grade Purified 16-0037-85 500μg
PeproTech- biogems Anti-Human CD3 SAFIRE Purified 05121-25 100μg/500μg
PeproTech 重組人IFN-γ (Animal Free) AF-300-02 100μg/250μg/500μg/1mg 50ng/ml
PeproTech 重組人IL-1α (Animal Free) AF-200-01A 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg 0.1ng/ml
PeproTech 重組人IL-2 (Animal Free) AF-200-02 50μg/100μg/250μg/500μg/1mg 30ng/ml
【推薦試劑】
生產商 產品名稱 產品編號 產品規格
PeproTech 重組人Flt-3 Ligand (Animal Free) AF-300-19 10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg
PeproTech 重組人IL-7 (Animal Free) AF-200-07 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg
PeproTech 重組人IL-15 (Animal Free) AF-200-15 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg
PeproTech 重組人SCF (Animal Free) AF-300-07 10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg
注：Animal
Free意為無動物成分。無動物成分的重組細胞因子在生產過程中不會有任何動物源性物質，尤其是牛蛋白的混入，使得最終獲得的重組人蛋白中不含任何動物成分。這樣可避免動物病原體(如瘋牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的機體異種排斥和過敏反應，因此細胞治療的體外細胞培養過程中最好使用無動物成分的重組細胞因子。
【參考文獻】
[1] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced
killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II clinical study.
Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133
【背景知識】
DC是“Dendritic
Cells”的縮寫，中文全稱為“樹突狀細胞”，因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。DC是由2011年諾貝爾獎獲得者、加拿大籍科學家Ralph
M. Steinman于1973年發現的，是目前發現的功能最強的抗原遞呈細胞(Antigen Presenting Cells,
APC)。已證實，DC是唯一能夠顯著刺激初始T細胞(Na?ve T
cells)增殖的APC，成熟的DC可以通過Ⅱ型組織相容性抗原（MHC-Ⅱ）等途徑提呈腫瘤抗原，有效抵制腫瘤細胞的免疫逃逸機制，而其它APC(如單核巨噬細胞，B細胞等)僅能刺激已活化的或記憶性的T細胞。DC是機體適應性T細胞免疫應答的始動者，在腫瘤免疫中具有極其重要的作用。
CIK是單個核細胞在CD3單抗和多種細胞因子(包括IFN-γ，IL-2等)的作用下培養獲得的一群以CD3+CD56+細胞為主要效應細胞的異質細胞群，其既具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，又具有NK細胞(自然殺傷細胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。
DC-CIK
(或DC+CIK)[1]是指與DC細胞共培養的CIK細胞，也可以說，最終的效應細胞是經DC體外活化的CIK細胞。多項研究表明，DC與CIK具有協同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表達及抗原遞呈能力均明顯提高，而CIK的增殖能力和體內外細胞毒活性也得以增強，因此DC-CIK較單獨的CIK治療更為有效。若將腫瘤抗原負載的DC與CIK共培養，可刺激產生腫瘤抗原特異性的T細胞，這樣的DC-CIK治療則兼具特異性和非特異性雙重腫瘤殺傷作用，比未負載腫瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更強，常被用于臨床和科研。
CIK細胞和DC細胞是細胞免疫治療的2個重要組成部分，兩者聯合可確保高效的免疫反應。