隨著抗菌藥物耐藥現象日益加劇，準確的藥敏試驗結果對臨床優化治療方案和提高感染性疾病的診治能力至關重要。因此，建立和完善體外藥敏試驗的標準化操作規程，是加強微生物室自身能力建設、實現經驗性向個體化治療轉型的基本要求。CLSI制定的藥敏試驗標準是我國遵循的指導性文件，其每年修訂的內容都引起臨床工作者的廣泛關注。本文將重點介紹2015年CLSI
M100－S25[1]新增的Carba NP試驗和流行病學cut－off值(epidemiological cut－off values,
ECVs)的概念，以供臨床實驗室參考。
一、Carba NP確證試驗
Carba NP確證試驗是CLSI M100－S25(2015年)新增的一種對腸桿菌科、銅綠假單胞菌和不動菌屬細菌中碳青霉烯酶的表型檢測方法。該試驗采用比色法，目前可用于流行病學研究或感染控制，尚不推薦作為臨床常規使用。
研究表明，Carba NP試驗在檢測腸桿菌科、銅綠假單胞菌和不動菌屬細菌的肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella
pneumoniae carbapenemase, KPC)、新德里金屬β內酰胺酶(New Delhi
metallo－beta－lactamase, NDM)、verona integrin－encoded
metallo－β－lactamase(VIM)、imipenemase metallo－β－lactamase(IMP)、SPM和S.
marcescens
enzyme(SME)型碳青霉烯酶方面具有較好的敏感度(>90%)和特異度(>90%)，而對其他類型的碳青霉烯酶，敏感度和特異度則存在差異。例如，Carba
NP實驗對OXA－48型碳青霉烯酶敏感度較低，僅為11%。此外，CLSI研究顯示，2株對碳青霉烯類藥物MIC較低而KPC酶陽性的菌株(1株對3種碳青霉烯類均敏感的陰溝腸桿菌；1株對美羅培南敏感，而對亞胺培南和厄他培南中介的大腸埃希菌)對該試驗未表現陽性。
如果實驗室使用M100－S20(2010年)中碳青霉烯類MIC折點，則需對Carba
NP試驗的適用條件和報告方式進行調整。當腸桿菌科細菌的亞胺培南或美羅培南MIC為2～4 mg/L，或厄他培南MIC為2
mg/L時，實驗室在使用修訂后的碳青霉烯類MIC折點之前，都需要進行Carba NP試驗或其他碳青霉烯酶的確證試驗。此時，對于Carba
NP試驗陽性的菌株，無論MIC值為多少，均報告為碳青霉烯類耐藥；如果Carba
NP試驗為陰性，則根據CLSI折點(M100－S20)判斷碳青霉烯類的敏感性。值得注意的是，并非所有產碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌Carba
NP試驗都為陽性。
1．Carba NP試驗試劑和配制說明：
2．檢測流程：
(1)對于每株待測菌、質控菌株和未經處理的試劑質控，分別取兩個微量離心管(標記為"a"和"b")。(2)向每管中加入100
μl細菌蛋白提取液。(3)對于每株待測菌，從過夜培養的血平板上各取一接種環(1 μl)的細菌，加入管"a"和管"b"中進行乳化。每管渦旋5
s(未經處理的試劑質控僅含細菌蛋白提取液)。注意不要從選擇性培養基、含抗生素或含其他試劑的選擇性平板上挑取菌落。(4)加入100 μl
A液到管"a"。(5)加入100 μl B液到管"b"。(6)將離心管充分渦旋。(7)35 ℃±2 ℃下孵育不超過2 h。2
h內呈陽性的菌株可報告為產碳青霉烯酶。
3．結果解讀(見表2)：
(1)未經處理的試劑對照管"a"和"b"：兩管必須是紅色或橙紅色。如其中任何一管為其他顏色，則試驗結果無效。(2)接種管"a"：必須是紅色或橙紅色，如果管"a"為其他顏色，則結果無效。(3)接種管"b"：紅色或橙紅色為陰性；淺橙色、深黃色或黃色為陽性；橙色則結果無效。
4．結果報告：
結果陽性報告為產碳青霉烯酶；陰性報告為未檢出碳青霉烯酶。
5．質控：
(1)實驗當天需檢測陽性和陰性質控菌株，以及未經處理的試劑質控管。將肺炎克雷伯菌ATCC
BAA－1705作為產碳青霉烯酶的陽性對照；肺炎克雷伯菌ATCC
BAA－1706作為陰性對照。(2)未經處理的試劑質控管"a"和"b"必須為陰性(紅色或橙紅色)。(3)當管"a"為紅色時，管"b"中加入亞胺培南可能使管"b"顯示橙紅色。
二、對碳青霉烯酶檢測的更新
醫院感染控制或流行病學調查可能需要對產碳青霉烯酶的腸桿菌科、銅綠假單胞菌和不動菌屬細菌進行檢測。目前這些檢測方法尚未用于臨床常規中。如果使用當前CLSI的藥敏折點，產碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌通常對1種或1種以上碳青霉烯類中介或耐藥(厄他培南不敏感是產碳青霉烯酶的最敏感標志)，同時對1種或1種以上三代頭孢菌素耐藥(如頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢唑肟和頭孢曲松)。然而，某些產碳青霉烯酶的菌株[如產SME或imipenem－hydrolysing
β－lactamase(IMI)型碳青霉烯酶]常對上述頭孢菌素敏感。當實驗室使用M100－S20(2010年)文件中碳青霉烯類對腸桿菌科細菌的MIC折點時，即亞胺培南或美羅培南MIC為2～4
mg/L或厄他培南MIC為2 mg/L時，實驗室應對懷疑產碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌進行改良Hodge試驗、Carba
NP試驗和(或)分子檢測。這3種檢測方法的比較見表3。
三、ECVs的引入
CLSI
M100－S25新增加了萬古霉素對痤瘡丙酸桿菌的流行病學cut－off值。當臨床考慮使用萬古霉素治療痤瘡丙酸桿菌感染時，由于缺乏足夠的臨床治療數據，因此目前尚無萬古霉素對痤瘡丙酸桿菌的MIC折點。根據ECVs，萬古霉素對未出現獲得性和(或)突變性耐藥的野生型痤瘡丙酸桿菌的MIC≤2
mg/L。ECVs可用于檢測對特定藥物敏感性下降的菌株。如果痤瘡丙酸桿菌獲得耐藥基因或基因突變，可引起其對萬古霉素敏感性下降(MIC≥4
mg/L)。根據既往經驗，非野生型痤瘡丙酸桿菌感染可導致萬古霉素治療效果不佳。
1．ECVs的定義：
ECVs是根據體外藥敏表型(MIC值)來區分有無獲得性和(或)突變耐藥細菌，該MIC值即為ECVs。ECVs僅基于體外藥敏數據。"野生型"(wild－type，WT)指MIC值≤ECV，說明菌株無獲得性和(或)突變耐藥；而"非野生型"(non－wild－type，NWT)指MIC高于ECV，則菌株有獲得性和(或)突變耐藥。ECVs不同于臨床折點，主要用于標識NWT菌株的出現和發展。
2．ECVs的確定：
ECVs是通過收集和匯總不同來源細菌的MIC值來估計野生型菌株MIC值分布的上限獲得的。為了得到可靠的ECVs，必須具備以下條件，包括：(1)由于同一屬而不同種的細菌基因存在差異，只能確定單一菌種的ECV。(2)納入數據集中的MIC值必須是采用參考方法(如CLSI推薦的MIC肉湯稀釋法，該方法也需得到ISO－20776－1認可)確定的。(3)用于確定ECV的數據集應不少于100株菌，且必須來源于至少3個獨立的實驗室。(4)每個獨立實驗室數據集包括的MIC值分布應盡可能在稀釋范圍內(且為可評價的)，該條件特別適用于估計野生型菌株。在合并ECV數據之前，應檢查每個實驗室的MIC分布數據。如果檢測的最低濃度為眾數，則這些數據不能納入數據集。
估算ECV最簡單的方法是通過目測確定野生型和非野生型MIC分布的界限，但存在偏倚。而統計學方法能夠很好地去除觀察者估算時的偏倚。因此，當野生型和非野生型存在明顯重疊時，更傾向于統計學方法。
3．如何使用ECVs建立臨床折點：
臨床折點的建立需基于大量數據，包括抗菌藥物的MIC分布、細菌種群、體內和體外藥效學、人體藥代動力學和臨床療效。因此，MIC分布和ECVs都是用于建立臨床折點的一部分。
4．臨床微生物室如何使用ECVs：
例如，萬古霉素可用于治療痤瘡丙酸桿菌感染，但目前尚無足夠的數據建立臨床相關折點。這主要與獲得性耐藥菌株的出現和缺乏臨床療效數據有關。
當萬古霉素MIC處于或低于ECV(≤2 mg/L)時，可以推斷菌株為野生型；當萬古霉素MIC為≥4 mg/L時，菌株應重新進行藥敏檢測以確定是否為非野生型。ECVs不可用于臨床折點，且檢測的MIC結果不應報告為敏感、中介或耐藥。
四、主要細菌的相關更新
M100－S25文件在"建議檢測和報告的藥物"部分刪除了加替沙星、格雷沙星、洛美沙星、替卡西林和曲伐沙星。
1．腸桿菌科細菌的相關更新：
CLSI 2015年將磷霉素加入"常規試驗和報告藥物U組"，強調僅用于泌尿道大腸埃希菌的檢測和報告。同時增加了阿奇霉素和培氟沙星對傷寒沙門菌和沙門菌屬的藥敏折點，見表4。
2．厭氧菌：
大多數厭氧菌感染為多種病原菌聯合感染，包括β內酰胺酶陽性和陰性的菌株。臨床實驗室通常不必對多種病原菌進行藥敏試驗。而2015年新版標準擴大了對厭氧菌進行藥敏試驗的范圍，建議如果需要，應對最可能耐藥的微生物(如脆弱類桿菌)進行藥敏試驗并報告結果。此外，當抗菌藥物對厭氧菌的MIC為中介時，臨床應使用最大劑量并聯合適當的輔助治療，使藥物在膿腫和(或)低灌注的組織中達到最佳濃度。
3．肺炎鏈球菌：
建議檢測苯唑西林紙片質量。使用紙片擴散法時，實驗室最好通過金黃色葡萄球菌ATCC 25923檢測苯唑西林紙片質量，結果可接受的范圍為18～24 mm(MH平板)。
4．腸球菌屬：
將磷霉素加入"常規試驗和報告藥物U組"，僅用于泌尿道糞腸球分離株的檢測和報告。
五、關于藥敏質控和試驗操作的更新
M100－S25除新增了培氟沙星對大腸埃希菌ATCC25922紙片法的質控范圍(25～33
mm)外，還修訂了下列藥物對肺炎克雷伯菌ATCC700603的質控范圍，見表5。此外，文件增加了實驗室對大腸埃希菌ATCC
35218的處理建議，以確保其產生β內酰胺酶，可用于β內酰胺類/β內酰胺酶抑制劑藥物的質控。ATCC 35218需在－60
℃儲存，如果連續傳代，可能丟失含有編碼β內酰胺酶基因的質粒。為了確保大腸埃希菌ATCC
35218保持其產生β內酰胺酶的能力，當首次從冷凍或凍干保存菌株傳代時，應通過紙片或稀釋法檢測其對氨芐西林、哌拉西林或替卡西林的活性。如果上述抗菌藥物檢測結果在質控范圍，則大腸埃希菌ATCC
35218可作為β內酰胺類/β內酰胺酶抑制劑的質控菌株。
參考文獻
[1]CLSI.
Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing:
Twenty-Fifth Informational Supplement. CLSI document M100-S25. Wayne,
PA: CLSI, 2015.