CRISPR功能研究入門指南

　　基因組測序讓我們意識到，人類基因組只有一小部分被翻譯成蛋白質。其實我們基因組的80%會轉錄成RNA，但這些轉錄本大多不生成蛋白質。近年來人們發現非編碼RNA往往與人類疾病有關，不過絕大多數非編碼RNA的功能還是未知的。CRISPR/Cas9在這方面可以起到重要的作用。

　　CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR抑制（CRISPRi）特別適合分析非編碼RNA的具體功能。雖然越來越多的研究人員開始使用CRISPRa和CRISPRi，但它們其實還剛出爐不久。“我們都是這些技術的測試員，”加州大學的Jacob Corn說。

　　最近The Scientist雜志聯合CRISPR的開發者和使用者共同編寫了使用CRISPRa和CRISPRi的入門指南，幫助研究者們更好的研究和調節基因組的編碼和非編碼區域。

　　CRISPRa

　　催化失活的Cas9（dCas9）連上轉錄激活子，可以有效促進基因組特定位點的轉錄，這一工具被稱為CRISPRa。

　　cDNA過表達是上調個別基因的表達水平的常用方法。與這種方法相比，CRISPRa使用起來更加簡單，而且可以同時激活多個基因。未來CRISPRa將正在成為RNA研究的金標準，加州大學的Mitchell O’Connell指出。O’Connell在CRISPR先驅Jennifer Doudna的實驗室從事博士后研究。

　　目前CRISPRa已經發展出好幾個新版本。MIT的CRISPR先驅張鋒通過改造dCas9和sgRNA優化了轉錄機器的招募，成功將RNA表達水平提升了一個數量級。此前研究者們是把活化轉錄的結構域連接在dCas9的末端，但這種系統往往不能持續啟動基因轉錄。張鋒及其同事解析了dCas9、sgRNA和目標DNA結合時的分子結構，并以此為基礎進行了改良。他們發現，RNA從Cas9復合體伸出的兩個小環是更好的連接位點，這樣活化結構域在招募轉錄機器時就更加靈活。張鋒團隊用自己的改良版CRISPRa激活了十個基因。研究顯示，這些基因的轉錄都得到了兩倍以上的增漲，許多基因的活性甚至有了幾個數量級的增加。

　　張鋒實驗室還找到了利用CRISPRa控制基因轉錄水平的新途徑。他們發現，CRISPRa離轉錄起始位點越近，轉錄激活的效果就越強。如果CRISPRa靶向轉錄起始位點的上游（超過200bp），觸發的轉錄就會更為溫和，更接近生理水平。張鋒實驗室的博士后Silvana Konermann介紹道。在一項還未發表的研究中，她通過這一途徑揭示了基因表達量與表型強度之間的線性關系。

　　加州大學的Jonathan Weissman也在開發轉錄激活子并建立相應的規則。他的研究團隊在dCas9上融合了一連串短肽（也就是SunTag array），這些短肽相當于一套分子掛鉤，能在細胞中招募多拷貝的轉錄激活子，生成強勁的信號（Cell, 159:647-61, 2014）。“我們現在就在使用這個系統，”Corn說。“這是一套完整的體系，我們招募轉錄激活子，也很清楚它們的使用規則。”

　　哈佛大學的著名遺傳學家George Church也構建了改良版的CRISPRa。人們在基因表達研究中，主要還是一次針對一個基因。Church領導的研究團隊將三個活化結構域（VP64、p65、Rta）連接起來，然后融合到dCas9的末尾。研究顯示，Church的系統可以揭示一連串基因回路對生物過程的影響，也可以精確指導干細胞分化，生成再生醫學所需的移植器官。研究人員用自己開發的技術誘導干細胞分化成大腦神經元。他們發現，Cas9在編程神經元發育時比傳統方法好40倍。Bassett指出，在自己使用新一代CRISPRa的過程中，Church這個系統的成功率最高。與Weissman、張鋒的CRISPRa不同的是，Church的系統目前還沒有用于大規模功能獲得性篩選。

　　至于哪個版本的CRISPRa最終能夠脫穎而出，專家們認為現在下結論還為時尚早。在自己的研究領域多嘗試幾種方法是沒有壞處的，更新更好的方法可能也即將問世。“摸索CRISPRa在不同研究中的應用是我們每一個使用者的義務，”Corn說。

　　現在大多數研究是在既定細胞系中使用CRISPR，而哥倫比亞大學的Uttiya Basu準備將CRISPRi和 CRISPRa用于初級免疫產生的混合細胞。這是一項很有挑戰性的工作，“不同類型的細胞有著不同的攝取能力，”Basu說。“而且初級免疫細胞會在一段時間后死亡，”導入CRISPR系統是有時間限制的。

　　近年來，CRISPR技術如風暴一般席卷了生物學領域，它本身也在不斷的更新換代。現在，CRISPR–Cas9系統已經不只是簡單的基因組編輯工具。斯坦福大學的齊磊（Lei Stanley Qi）和加州大學舊金山分校的Wendell A. Lim教授在Nature Reviews Molecular Cell Biology雜志上發表綜述文章，探討了CRISPR–Cas9在基因組編輯以外的技術發展和廣泛用途。Wendell A. Lim和齊磊都是CRISPR領域的先行者，在Cell等頂級期刊上發表了多項突破性成果。