CRISPR女王：她的生命被CRISPR照亮

一位多年來埋頭于實驗室枯燥生活的微生物學家，突然有一天由于基因編輯技術站在了聚光燈下

　　 現年48歲的Emmanuelle Charpentier在過去二十年學術生涯中輾轉去過了5個國家九所不同的研究院，“我總是不得不從零開始，親自構建新的實驗室，”她說。45歲之前Charpentier還無法雇用她自己的技術員，一般獲得的也都是短期資助。然而在2012年這一切開始變得不同了，一種被稱為CRISPR（規律成簇的間隔短回文重復）的基因編輯技術引發了熱潮，Charpentier也成為了這種革新整個生物醫學界技術的關鍵發明者。

　　 這一年，Charpentier贏得了十個著名的科學獎項，并且正式接手德國柏林馬普研究院感染生物學研究所所長一職，同時她與其他學者共同創辦的基因治療公司：CRISPR Therapeutics 也成為了世界上融資最多的臨床生物技術公司之一。去年9月，Charpentier的電話一直響個沒完，世界各地的記者都希望能聯系上她，因為不少人認為她也許能獲得當年的諾貝爾獎。

　　 對于Charpentier來說，學術風頭并不是她想要的，“法國哲學家Jean-Paul Sartre曾說過，‘得獎會讓你禁錮在一個小圈子里’，我希望我能保持工作的狀態，讓自己的腳踏實的踩在地上，”她說。為此Charpentier一直在努力，本周（4月26）她的研究組還在Nature雜志上發表文章，提出了一種更簡單更有效的CRISPR系統：CRISPR-Cpf1（新一代CRISPR系統）。

　　人生的意愿與軌跡

　　 Charpentier看上去又瘦又小，一雙漆黑的眼睛讓她顯得很焦躁，她自小生活在巴黎附近的一個小鎮上，從一開始對于自己想要什么她就有了一個清晰的概念——推動醫學發展，這來自于居住在古老修道院的一位傳教士嬤嬤，“這樣你就能獨自面對自己”。

　　 Charpentier的父母并不反對，雖然Charpentier也喜愛鋼琴和芭蕾，但她最終還是進入到生命科學研究領域，在巴黎第六大學讀完本科后，她決定就近在巴斯德研究所攻讀博士學位，這是一所在基礎研究和抗生素耐藥性研究方面具有良好聲譽的研究所。Charpentier的博士論文內容為基因組和細胞之間遷移的細菌DNA片段分析，這些片段涉及耐藥性傳遞。

　　 “我當時的夢想是在巴斯德研究所領導一個實驗室工作，而這需要博士后工作經歷，”因此Charpentier開始準備，她向美國多家實驗室投遞了50多份求職信，最后選擇了洛克菲勒大學Elaine Tuomanen實驗室，進行肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）的研究，這是一種造成肺炎、腦膜炎和敗血癥主要死因的病原體，具有一種特殊的可移動遺傳元件，能在維持其病原性的前提下移動基因組。

　　 為了了解這種病原體如何控制這些元件的分子機制，Charpentier帶著一絲惶恐來到了紐約，不斷不斷的努力工作，沉浸在實驗中，之后她又進入了紐約大學醫學院皮膚細胞生物學家Pamela Cowin的實驗室，有機會接觸到了小鼠功能性基因的工作原理。

　　 在這里，Charpentier很快發現操控轉基因小鼠要比操縱細菌難得多，她花了兩年時間完成了毛發生長調控研究。之后又搬回了歐洲，“我了解了細菌中每個生化途徑是如何進行的，”當時小分子RNA在基因調控方面的功能研究風靡一時，許多研究項目都在向這方面傾斜，Charpentier也在產膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）中發現了調控一種重要毒性分子合成的RNA。

　　CRISPR與維也納

　　 就是在維也納，Charpentier第一次開始思考 CRISPR。在本世紀初，這還是一個冷僻研究領域，只有少數的微生物學家注意到了這種部分細菌中存在的抗病毒防御系統組成部分。細菌能拷貝一個侵入病毒的部分DNA，然后將其插入到基因組中，從而在病毒下次來犯時，認出它來，將其DNA切斷。不同的CRISPR系統在這個襲擊過程中具有不同的方式，但所有已知的系統都包含一個RNA分子，也就是CRISPR RNA。

　　 Charpentier希望能在S. pyogenes 基因組中找到調控RNAs的位點，為此她找到了分子微生物學家J?rg Vogel（曾研發出了一種大規模繪制基因組RNAs圖譜的方法），后者同意完成S. pyogenes繪制圖譜。

　　 在此基礎上，Charpentier等人首先注意到了一種超富集小分子：trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA)。“最初，我們發現了一種新的RNA：tracrRNA，與CRISPR-Cas9系統相關，相關研究結果我們于2011年發表在Nature雜志。”

　　 TracrRNA的序列和在基因組上的位置正是Charpentier生物信息學分析中，預測靠近CRISPR 位點的地方，因此他們意識到這個分子很可能參與了之前未曾被發現的 CRISPR 系統。Charpentier等人又開始了漫長的實驗，希望能了解這個系統，最終他們發現CRISPR 系統包含了三個元件：tracrRNA, CRISPR RNA和 Cas9酶。

　　 這令他們感到十分驚訝：“其它CRISPR 系統只包含一個 RNA 和許多蛋白，沒有發現這其中涉及兩種RNAs，”Charpentier說。這一系統是如此的簡單樸實，因此Charpentier斷定未來有一天，它將會成為一種強大的基因工程工具。

　　 但CRISPR 系統究竟是如何工作的呢？

　　Charpentier懷疑兩個 RNA實際上可能相互作用，指引Cas9找到病毒中的一個特殊DNA序列。這個觀點有些劍走偏鋒，研究組主要進行的是蛋白研究，而不是RNAs研究，但是Charpentier“行事總是出乎人意料，她其實是一個非常反傳統的人”，Tuomanen說。

　　 對于當時的情景，Charpentier回憶道，“我很難說服我的學生們來進行這個關鍵的實驗，驗證兩個RNAs是否相互作用，但最終維也納大學的一個學生Elitza Deltcheva自愿來幫忙。”

　　 在當時的CRISPR研究“小圈子”，Charpentier還是默默無聞的，2010年她帶著自己的成果第一次參加了荷蘭瓦赫寧根的CRISPR 會議，那時她剛剛將研究組成果投遞給Nature。“她的出現成為了會議的一大亮點，這是一個美麗的故事，而且讓人感到意外，”瓦赫寧根大學的微生物學家，也就是當時會議的組織者John van der Oost說。

　　 之后在2011年的美國微生物學會會議上，Charpentier遇到了加州大學伯克利分校的結構生物學家 Jennifer Doudna，Charpentier立刻就被她迷住了，“從第一眼看到她，我就喜歡上了她的干練。”

Jennifer Doudna（左）和Emmanuelle Charpentier（右）

　　 兩位女科學家開始了合作，進入了CRISPR系統研發的第二個關鍵階段——Cas9如何剪切DNA，隨著其背后的秘密被解開，研究人員發現這一系統確實可以用于靶向基因組，修改序列，這一技術也開始像旋風一樣，席卷了世界各地的各大實驗室……

　　兩個決定

　　 與此同時，Charpentier作出兩項重要的決定。首先就是她最初的夢想——為推動醫學做點什么，她聯系了巴黎一家著名的醫藥公司賽諾菲Sanofi，嘗試共同組建公司，探索人類疾病的基因治療方法。就此 CRISPR Therapeutics 成立了。

　　 第二個決定是她搬到德國，成為了德國漢諾威醫學院的一位教授，并最終進入了馬普研究院，專心致力于基因調控的基礎研究，在那里，她終于有了自己的技術人員，創建了一個16名博士和博士后組成的實驗室。現在她有了越來越多的資金資助，也有了更為寬裕空閑的環境，她開玩笑的說，未來說不定能找到時間讀讀哲學。

　　 但現在她的時間安排得滿滿當當，她的焦點依然是CRISPR 系統，最近其研究組發表的一篇論文就是比CRISPR–Cas9更加簡單的一種系統，他們發現CRISPR相關蛋白Cpf1具有一個以往在這一酶家族中從未觀察到的特征：Cpf1對RNA和DNA顯示雙重切割活性。不同于CRISPR-Cas9，Cpf1能夠自身加工前體crRNA，隨后利用加工的RNA特異性地靶向和切割DNA。不需要宿主來源的核糖核酸酶（Rnase）及tracrRNA使得它成為了迄今為止已知最簡單的CRISPR免疫系統。

　　 不過除了CRISPR之外，Charpentier還有另外四個項目主題，這包括病原體如何與宿主細胞相互作用，以及與調控細胞染色體行為的分子復合物相互作用的分子機制。

　　 至于CRISPR的ZL問題，Charpentier似乎并不太關心。當時Charpentier和Doudna在 2013年3月提出ZL申請，而哈佛-麻省理工的Broad研究所的張鋒在2013年10月遞交的申請，但由于張鋒所屬單位申請了特殊快速通道，他在2014年4月先于Doudna 和 Charpentier 取得ZL權。因此加州大學要求 USPTO 重新審查ZL資格，并提出干擾訴訟，希望真正的技術發明者能取得ZL。

　　 其實關鍵問題在于，之前USPTO 是將ZL授予首次發明人員，但這個規定在2013年修正，現在的ZL是由先申請者得到。Doudna 和 Charpentier 在這條規定修改前就遞交申請，因此一切還有待探討解決。為此，Charpentier拒絕討論這個問題，她表示自然有ZL律師來解決。

　　 回顧過去，Charpentier感嘆她的生活也許本來不需要如此艱難，現在有許多資助幫助年輕的研究人員創立自己的獨立實驗室，雖然她已經部分實現了最初的夢想，但她的腳步并未就此停止，“我并未改變，我也不會變。我成為了能讓自己站在這里的科學家，這也就是我希望一直成為的科學家”，她說。

　　 但還是有一些東西已經發生改變了，Charpentier不再是局外人：她已經成為了原來CRISPR“小圈子”快速擴展后的權威人員，無數的團體邀請她去演講，而她不斷想做的事情就是繼續報告一些完全不同，卻很重要的發現，她說，“對此我已經做好了準備”。