基因工程小鼠基因型PCR鑒定的基本原則是利用基因工程小鼠基因組與野生型小鼠基因組的序列差異，以小鼠基因組DNA為模板進行PCR，并以凝膠電泳對比不同基因型特異產物的大小，根據條帶大小來區分小鼠的不同基因型。上期我們講述了CRISPR/Cas9條件性基因敲入鼠的鑒定，今天我們就開始學習CRISPR/Cas9基因敲入鼠的鑒定。
驗證F1代陽性鼠打靶是否正確
引物設計
為了驗證外源DNA序列是否正確插入，兩邊同源臂是否打靶正確，使用F1/R1驗證5'arm端，F2/R2驗證3'arm端，也可再多設計一對位于插入區域內的引物。鑒定為陽性的鼠繼續進行Southern Blot的驗證。
預期片段大小
條帶1的大小為：F1/R1擴增的5'arm端，包括野生型骨架區+同源臂+敲入區域；
條帶2的大小為：F2/R2擴增的3'arm端，包括野生型骨架區+同源臂+敲入區域；
備注：條帶1和條帶2是對同源臂骨架區的驗證，片段一般是2kb以上，擴增難度較大。賽業生物在交付之前會進行驗證，您無需再進行驗證。
電泳結果
若電泳結果同時有條帶1、條帶2，則為陽性敲入鼠。
若沒有擴增出目的條帶的則為陰性鼠（野生型或其它突變）。
測序
除了PCR鑒定，還需要將產物送測確認。F1/R1擴增產物的測序引物設在靠近loxP位點的5'arm上（圖示中的F3），F2/R2擴增產物的測序引物設在靠近loxP位點的3'arm上（圖示中的R3）。
純/雜合的基因型鑒定
引物設計
交付的F1代小鼠已驗證過同源臂打靶的正確性，現只需通過驗證目的基因小于1kb的片段即可，設計一條引物位于敲入區域的上/下游，用于區分純雜合。
預期片段大小
條帶1的大小為：F4/R4擴增的野生型片段大小；
條帶2的大小為：F4/R4擴增的插入片段大小+同源臂；
條帶3的大小為：F5/R4擴增的部分插入片段大小+同源臂；
備注：使用短片段體系，如果插入片段過大，F4/R4可能是擴增不出來的。
電泳結果
若電泳結果只有條帶3或者同時有條帶2，則判斷為陽性純合鼠（KI/KI）；
若電泳結果只有條帶1，則判斷為野生鼠（+/+）；
若電泳結果有條帶1和條帶3或有同時有條帶2，則為陽性雜合鼠（KI/+）。
