【方法二】
1、（用IDT工具）設計sgRNA，使其Spacer與DNA靶序列互補，提交給IDT定制合成sgRNA；
2、將sgRNA與Cas9蛋白混勻，形成RNP；
3、將RNP通過電轉染等導入細胞或細胞核；
4、通過sgRNA的Spacer識別DNA靶序列，通過Cas9蛋白識別PAM序列，對DNA進行剪切；
5、對DNA斷裂處進行修復
①進行非同源末端連接修復，實現基因敲除；
②（用IDT工具）設計供體DNA模板，進行同源重組修復，實現基因敲入、敲除、沉默等。
Alt-R? crRNA序列設計示意圖
Alt-R? CRISPR-Cas9相關：
1、Alt-R? crRNA：由19-20nt特異性序列（定制）和16nt通用序列融合形成，相比野生型，序列更短，中靶率更高。經化學修飾防止被細胞核糖核酸酶降解，必須與tracrRNA一起使用以形成gRNA。
2、Alt-R? crRNA XT：相比Alt-R? crRNA，經其他化學修飾，用于高核酸酶條件或帶有Cas9 mRNA的實驗，可提高編輯的穩定性。必須與tracrRNA一起使用。
3、Alt-R?
sgRNA：由crRNA和tracrRNA序列融合組成的單個RNA，含有19-20nt的特異性序列（定制）和80nt通用序列，經化學修飾，穩定性更高，用于高核酸酶條件或帶有Cas9
mRNA的實驗。相比體外轉錄的sgRNA，減少細胞免疫反應，更小細胞毒性。
4、Alt-R? tracrRNA：通用67nt序列，遠遠短于野生型的89nt，縮短后性能提高，經化學修飾，具有核酸酶抗性。可提供熒光標記，檢測轉染效率。必須與crRNA一起使用以形成gRNA。
圖.穩定表達Cas9蛋白的HEK-293細胞，轉染Alt-R? crRNA(未標記):tracrRNA(標記)，轉染后48小時，熒光顯微鏡下10倍放大。
5、Alt-R? Cas9核酸酶：S. pyogene來源Cas9，大腸桿菌表達純化，添加核定位序列（Nuclear localization
sequence，NLS）和C端6-His標簽。Alt-R? HiFi
Cas9高保真核酸酶，經序列優化，提高中靶率，降低脫靶率。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9核酸酶=610pmol。
6、Alt-R? Cas9切口酶：S. pyogene來源Cas9，大腸桿菌表達純化，添加核定位序列NLS和C端6-His標簽。其中Alt-R?
Cas9 D10A切口酶中RuvC-like內切酶結構域功能失活，對DNA靶向鏈進行單鏈切割。Alt-R? Cas9
H840A切口酶，HNH結構域失活，對非靶向鏈單鏈切割。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9切口酶=610pmol。
7、Alt-R? dCas9蛋白：S.
pyogene來源Cas9，大腸桿菌表達純化，喪失內切酶功能，添加核定位序列NLS和C端6-His標簽。dCas9蛋白可用于CRISPRi，進行基因下調（knockdown）等，相比RNAi，由于CRISPRi需要在轉錄起始位點附近才能發揮功能，其脫靶率遠低于RNAi。Alt-R?
dCas9蛋白，以10μg/μL的溶液提供。100μg dCas9蛋白=610pmol。
8、Alt-R? Cas9電穿孔Enhancer：是Cas9特異性的載體DNA，當使用原代細胞或難轉染細胞時，可提高Lonza(原Amaxa）Nucleofector核轉染系統等電穿孔設備對RNP的轉染效率，進而提高基因編輯效率。
9、Alt-R? HDR Enhancer：小分子化合物，可提高同源重組修復概率。在包括貼壁、懸浮的大量細胞系中均有活性，可用于Cas9核酸酶、Cas12a（Cpf1）核酸酶。
10、Alt-R? HDR供體寡核苷酸：專門為同源重組修復基因敲入開發，具有比標準寡核苷酸更高的穩定性和更高的摻入率，可同時用于Cas9核酸酶和Cas9切口酶。