CRISPR／Cas9技術，熱度背后的冷思考

近年來，CRISPR/Cas9 基因編輯技術正在給整個科研界帶來革命性變化，該技術使用 CRISPR 系統將 Cas9 蛋白和向導 RNA 注入小鼠受精卵，就能輕松實現基因敲除，同時，注入 Donor DNA 則可實現基因敲入，甚至國際著名學術期刊 Genome Biology 有文章指出這項新技術將很快取代使用胚胎干細胞的基因修飾，看起來小鼠胚胎干細胞基因修飾技術的終結不可避免。

然而，事實是這樣嗎？

脫靶效應仍存爭議

CRISPR/Cas9 這一被稱為 “魔剪” 的基因編輯工具在基因工程應用方面被寄予厚望。但是，脫靶效應這一有爭議的老問題一直影響著 CRISPR/Cas9 系統的應用。有文獻報道，CRISPR/Cas9 的切割是通過 gRNA 與基因組位置之間 20bp 堿基的配對，且配對堿基的 5′ 端需要有 PAM 結構，再引導 Cas9 作用實現的，但是 CRISPR/Cas9 與靶位點識別的特異性主要依賴于 gRNA 與靠近 PAM 處 10-12bp 堿基的配對，而其余遠離 PAM 處 8-10bp 堿基的錯配對靶位點的識別影響不明顯，這項研究直接說明了 CRISPR/Cas9 存在嚴重的脫靶性，即該技術可以發生非特異性切割，引起基因組非靶向位點的突變，這樣會造成研究結果的不確定性。

去年在 Nature Methods 雜志上發表的研究 “Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo” 通過全基因組測序分析表明 CRISPR 基因編輯會引入數百種不可預估的突變到基因組中，文章所指出的大規模脫靶問題，對 CRISPR 的應用提出了尖銳的挑戰，卻又在今年 3 月 30 日出現反轉并進行了撤稿處理。值得注意的是，這篇文章的第一作者 Kellie A Schaefer 和共同第一作者 Wen-Hsuan Wu 均同意撤稿，而包括通訊作者 Alexander G Bassuk 以及 Vinit B Mahajan 在內的其余四位作者則不同意撤稿。這與通常的撤稿情況還是有所不同，一般的撤稿大多數情況貌似都是通訊作者要撤稿，這篇爭議性文章通訊作者則堅持了自己的意見。顯然，這篇文章在研究者們內部也有巨大分歧。

不過，也有研究表明，CRISPR 的脫靶問題并沒那么嚴重：bioRxiv 期刊上的研究 “Whole genome sequencing of multiple CRISPR-edited mouse lines suggests no excess mutations.” 指出，多個采用 CRISPR/Cas9 技術基因編輯的小鼠品系經過全基因組測序后的結果顯示，CRISPR/Cas9 技術可在生物水平上精準地對基因組進行編輯，并沒有引入很多非預期的脫靶突變。

從以上這些充滿爭議性的研究可以看出，在應用 CRISPR/Cas9 技術時，其脫靶效應仍需謹慎考慮。綜合來看，現階段修飾準確、效果穩定、脫靶率極低的 ES 打靶技術仍是研究者的較優選擇。

CRISPR/Cas9 技術目前難以勝任復雜的基因編輯

另一方面，對于復雜的基因修飾（如條件性敲除、條件性點突變和大片段敲入等），CRISPR 有先天不足，因為此時需要 Donor DNA 與受精卵中基因組的特定位置發生同源重組，而同源重組的效率很低。相反，ES 打靶技術在這一方面因其 flox 區域范圍大、對于復雜結構寬容度高、打靶一次成功率高等特點，會有明顯的優勢。

CRISPR/Cas9 ZL之爭仍存爭議，商業化應用存在較大隱患

對于 CRISPR/Cas9 技術，還有一個值得關注的是其ZL使用問題，CRISPR/Cas9 ZL是基于多家機構的研究成果，產權不明晰，一直存在所有權之爭。

2017 年初，Broad 研究所和合作者們被授權了關于真核生物細胞（包括人類細胞）的基因組編輯的 CRISPR ZL，而加州大學伯克利分校和合作者授權的ZL是關于將 CRISPR 技術用于到 cell-free 系統中，并不是涉及真核細胞的基因組編輯。然而，后者對這一判決結果并不滿意，不滿意的結果就是啟動ZL抵觸程序（interference proceeding）。通過該程序一個發明者可以接手另一個發明者的ZL。

來自咨詢公司 IPStudies2017 年的數據顯示，目前還有 763 項和 Cas9 相關的ZL，在這些ZL中，有些聲稱擁有某些 CRISPR/Cas9 基因編輯方面的ZL權，隨著時間過去，這些ZL的擁有者或許也會試圖去維護他們的權利。

CRISPR ZL的紛爭給一些商業機構帶來了巨大的困惑。 首先，這意味著在未獲得 CRISPR/Cas9 技術ZL授權的商業機構購買基于 CRISPR/Cas9 技術提供的技術服務和產品，存在著較大的法律風險；其次，很難保證從一家ZL所有人購買的ZL能覆蓋所有應用需求。

應用 CRISPR/Cas9 技術發表的文章數量和質量低于 ES 打靶技術發表的文章

通過 Google 學術搜索 2013 年至今有關 CRISPR/Cas9 基因敲除和 ES 打靶技術有關的文章，搜索 knockout「embryonic stem cell」 or「ES cell」找到約 17300 條結果，搜索 knockout「crispr」or「cas9」找到約 16100 條結果。

針對兩個搜索結果，隨機抽檢搜索列表中的 100 篇文獻，統計分析后發現采用 ES 打靶技術發表的文章平均影響因子比 CRISPR/Cas9 技術發表的文章高 2.1 IF。因此，不論從文章質量還是數量，目前 CRISPR/Cas9 技術的影響力仍弱于金標準的 ES 打靶技術。不過不可因此否認 CRISPR/Cas9 技術未來潛在的影響力。

綜合以上幾個方面來看， 近年來一直處于風口浪尖的熱點 CRISPR/Cas9 基因編輯技術已經出現過多次類似的 “危機”，雖然有很多優勢，但學界仍需對其保持冷靜態度，隨著不同國家、不同地域的研究者們在 CRISPR 領域孜孜探索，也許這次一系列事件對 CRISPR 來說并非危機，反而是推動其發展的重要力量，我們也希望科學家們可以不斷去探索，優化工藝，以期將基因組編輯技術被更廣泛應用于臨床的疾病治療。