Disucssion
這里所介紹的使用熒光檢測的自動蝕斑計數方法有助于加快蝕斑檢測的速度。但是，有幾種類型的感染性病毒滴度實驗不會形成蝕斑。半數組織培養感染劑量（TCID50）就是另一種常用的病毒滴定方法。TCID50是終點稀釋測定法，用于確定感染50％接種細胞所需的病毒樣品稀釋度。由于蝕斑和TCID50分析都是要歷時多天且通量較低，因此急需其他更快的方法。帶有GFP標簽的腺病毒載體，可以通過流式細胞術檢測被感染的細胞，該方法通常需要大約一天的時間，樣品用流式方法和蝕斑實驗檢測具有相近的病毒滴度結果，這也使其成為蝕斑實驗頗具吸引力的替代方法。
已有報道稱使用陰離子交換柱的高效液相色譜（HPLC）方法可以定量桿狀病毒中的病毒顆粒。用SYBR綠色熒光染料標記病毒的DNA后，可在25分鐘內從陰離子交換柱上洗脫到病毒粒子。盡管該方法可以定量一個樣品中存在的病毒顆粒數量，但不一定檢測的是感染性病毒的數量。
此外，微滴式數字PCR（ddPCR）技術還可以量化反應中目標DNA的絕對數量。
此處描述的自動蝕斑計數方法是傳統蝕斑實驗的一大進步，對于不形成蝕斑感染的類“蝕斑”形成實驗也有所幫助。
例如，有種方法是用來確定腺病毒5（Ad5，一種輔助病毒）的感染性的，叫做灶斑形成實驗（focus formation assay）。
與蝕斑測定相似，用連續稀釋后的病毒樣品感染細胞，然后將細胞固定，與抗病毒的HRP偶聯抗體一起孵育，并用DAB底物顯色。用Ad5感染的細胞形成可計數的灶斑（Foci），結果以每毫升感染單元（ifu/mL）的形式表示。通過參數優化，Celigo可用于識別和計數單個灶斑，從而有助于提高灶斑的讀檢速度。
已有研究報道，一個類似的的熒光灶形成實驗（fluorescent focus formation
assay）可取代鼠諾如病毒（MNV）的蝕斑實驗。在該實驗中，MNV抗原帶有熒光標簽，由于病毒抗原的表達早于蝕斑的形成，因此該方法可以比蝕斑實驗更快速地定量感染滴度。Celigo在該實驗中可用于自動計數灶斑形成單元（focus-forming
units，FFU）。
最近也有不少研究，將將近紅外熒光與LI-COR Biosciences的胞內Western blot系統相結合，也證明了相對于傳統蝕斑實驗，在檢測靈敏度和速度方面也有一定程度的提高。不過，與LI-COR系統不同的是，我們采用的Celigo成像分析儀除了熒光檢測外，還可以用于非熒光斑塊的成像識別。
電阻抗技術也曾被用來評估細胞的病毒感染。研究表明，阻抗技術可用于實時監測病毒與細胞間的相互作用，并檢測某些抗病毒藥物的瞬時效用。但是，此技術的工作流程無法計算傳統蝕斑實驗中蝕斑形成單位（plaque-forming unit，PFU）的數值。
盡管有很多新方法用于感染性病毒滴度的定量測定，但蝕斑實驗和TCID50檢測仍是病毒滴定的金標準。這里描述的自動蝕斑計數方法是對傳統方法的完善和改進。通過利用自動計數和計算機算法來計數蝕斑，消除了分析者的主觀因素。使用Celigo成像分析儀還可以大大減少蝕斑計數的時間并提高數據一致性。當該技術應用于48孔或96孔板時，還可以顯著地提高樣品通量，從而助益于工藝優化環節中的大量樣品的分析。此外，通過整合蝕斑的熒光檢測，檢測時長可以減少40％，同時保持與傳統蝕斑實驗相同的計數性能。
使用基于計算機的成像系統的另一個優點是提高了數據的獲取、結果記錄以及可追溯性。同時，存儲和回顧圖像的功能使得設置實驗驗收標準更加清晰，并在培訓新的分析人員時提供指導和示范。在質量控制或良好生產規范（GMP）環境中，每項實驗運行的過程都同時需要分析和審核人員。通過應用具有自動蝕斑計數的板式成像分析儀，每一次分析結果和數據回顧的過程都能夠被完整地記錄，并且保存的原始細胞圖像以供監管機構進行備案或審計。
我們的目的是評估可以輕松應用到當前蝕斑實驗工作流程中的新技術，自動生成PFU值，并提高實驗的可靠性，靈敏度和速度。這項研究強調了通過自動成像技術等簡單的解決方案對經典檢測方法的改進。