Cell|棕櫚酰化如何抑制通道脫敏——嘌呤受體P2X7結構解析

　　胞外ATP信號主要通過兩大類膜蛋白：配體門控P2X受體例子通道和G蛋白耦連P2Y受體，其中P2X表達于多種真核細胞，介導多種生理過程，包括血小板激活、平滑肌收縮、突觸傳遞、痛覺、炎癥和凋亡【1】，是非常有潛力的藥物靶點。哺乳動物的P2X共有7種亞單位，聚集形成同源和異源三聚的非選擇性陽離子通道【2】。所有的亞單位都含有胞內N端和C端、組成孔道的兩個跨膜（TM）螺旋、含有ATP結合位點的胞外結構域。ATP能夠激活所有的P2X受體亞單位，但親和力差異很大；不同亞單位其脫敏的速度也不同。而P2X7受體的ATP親和力較低，完全缺乏脫敏現象【3】，而且P2X7在多種信號通路中作為細胞毒性受體，是P2X中唯一有此功能的亞單位。

　　P2X受體的胞內段被認為在受體的脫敏中有重要作用，但缺乏結構信息進行證明。盡管已經解析出多種P2X受體亞單位的結構，但都是N端和C端截短的結構，因為胞質結構域具有非常大的靈活性。目前為止，唯一包含P2X受體胞質結構域的結構研究是人源P2X3（hP2X3）受體【4】，揭示出N端和C端殘基形成了一個動態結構域“胞質帽子（cytoplasmic cap）”，其穩定性決定了孔道開放構型的時間長度，從而決定受體脫敏的速率。與其他P2X亞單位不同，P2X7有2個額外的元件構成獨特的胞質結構域：位于第2個跨膜結構域末端的胞質半胱氨酸富集區（C-cys），又叫C-cys錨定；C端的額外120個殘基組成cytoplasmic ballast。其中cytoplasmic ballast被認為特異性參與調控P2X7受體的孔道擴張和啟動細胞溶解信號轉導【5】，但缺乏相關的結構信息證據。

　　2019年10月3日，來自美國俄勒岡健康與科學大學的Steven E. Mansoor在Cell雜志上發表文章Full-Length P2X7 Structures Reveal How PalmitoylationPrevents Channel Desensitization，解析了全長的鼠P2X7受體在apo和ATP結合兩種狀態下的冷凍電鏡結構，并揭示出胞質元件C-cys錨定通過棕櫚酰基團將孔道螺旋錨定在膜上，以防止受體脫敏；胞質元件cytoplasmic ballast具有獨特的折疊，并包含鋅離子復合物和鳥苷核苷酸結合位點。

　　研究人員表達了全長野生型鼠P2X7受體（rP2X7-WT），ATP能夠激活rP2X7-WT，而且不會經歷受體脫敏。解析得到rP2X7-WT在apo（關閉狀態）和ATP結合（開放狀態）兩種的結構，分辨率分別達到2.9?和3.3?。rP2X7受體同樣具有三聚體結構，每個單體有1個親水性胞外結構域，2個跨膜螺旋（TM）和胞內段。與其他P2X亞單位不同，rP2X7有較大的胞內段，在apo和ATP結合兩種狀態中都可見。三個單體相互纏繞，每個單體從胞外域到跨膜域經歷順時針的相對旋轉120度，隨后從跨膜域到胞質域經歷逆時針旋轉120度。rP2X7中出現胞質帽子結構，在apo和ATP結合兩種狀態下都存在，因此是固定性結構；值得注意的是，胞質帽子結構被認為能夠控制hP2X3受體的脫敏動力學，在hP2X3受體激活時動態性存在。rP2X7單體的N端組成C-cys錨定，C端組成cytoplasmicballast結構。同時，N端至少一個殘基、C-cys錨定多個殘基具有棕櫚酰化修飾，驗證了之前關于C-cys錨定通過加強rP2X7和膜磷脂脂筏的相互作用而調控受體功能的猜想。

　　沒有ATP時，孔道關閉，rP2X7呈現出apo、關閉狀態；ATP存在時，ATP占據正位結合口袋，rP2X7呈現出激動劑結合、開放狀態。如何判定離子通道的開放與關閉狀態？Apo狀態下，TM2排列在rP2X7呈的孔腔上，殘基Q332、V335、S339、S342朝向孔道；S339定義胞外邊界，S342定義跨膜門控的胞內邊界，其最大直徑僅有0.1?，不能容許陽離子通過，故判定apo為關閉狀態。ATP結合的rP2X7其TM有持續的孔道，最小直徑為2.5?，足夠水合Na+通過，故判定為離子通道開放。如何解釋rP2X7受體對ATP的親和力相對較低？通過對比rP2X7受體和hP2X3受體的結構信息發現兩者在ATP結合的條件下并沒有較大的差別：都有ATP的U形位姿及其占據正位結合口袋的特征；與ATP形成氫鍵作用和離子鍵作用的幾乎所有氨基酸在兩者中高度保守。但是，在apo狀態下，hP2X3受體的ATP結合口袋其暴露的機率顯著高于rP2X7，rP2X7的結合口袋有一個狹窄的通道，阻礙了ATP結合口袋的暴露，導致rP2X7對ATP的親和力較低，但仍需要更多實驗的驗證。

　　rP2X7結構顯示出特有的18氨基酸的C-cys區域，那么C-cys錨定具有什么功能？分析發現，apo狀態下，C-cys錨定中至少4個半胱氨酸殘基、1個絲氨酸和N端1個半胱氨酸具有棕櫚酰化修飾。棕櫚基團的空間排布確保了C-cys錨定和N端固定在膜上。研究人員推斷這可以鎖定胞質帽子的位置，限制TM2的移動，從而抑制胞質帽子的解聚，抑制受體的脫敏。敲除rP2X7的C-cys錨定段和突變可以棕櫚酰化修飾的位點均能夠導致受體的快速脫敏現象。同時，另一個重要的胞質元件cytoplasmic ballast具有非常新型的折疊方式，3個β片層形成1個反向平行的β片層，然后是8個長度不一的α螺旋，被形成的螺旋束分開；緊接β片層之后，多肽骨架指向受體的對稱軸，其中每個單體的短螺旋（α9）間存在相互作用。進一步分析發現cytoplasmic ballast中含有Zn2+結合位點，對受體產生和運輸過程起重要作用；含有一個對GDP、GTP高親和力的結合位點。但無論是cytoplasmic ballast自身，還是Zn2+結合位點、鳥苷核苷酸結合位點，都對調控rP2X7受體的基本離子通道特性沒有調控作用。

　　總的來說，研究首次解析了全長的P2X7的冷凍電鏡結構，并揭示出P2X7胞質結構域的棕櫚酰化修飾抑制通道脫敏的機制，為研究P2X受體及其胞質結構域的結構和功能提供了新的視角。

　　原文鏈接：

　　https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.09.017

　　參考文獻

　　1. Burnstock, G., and Kennedy, C. (2011).P2X receptors in health and disease. Adv. Pharmacol. 61, 333–372.

　　2. Brake, A.J., Wagenbach, M.J., andJulius, D. (1994). New structural motif for ligand-gated ion channels definedby an ionotropic ATP receptor. Nature 371, 519–523.

　　3.Jarvis, M.F., and Khakh, B.S. (2009). ATP-gated P2X cation-channels. Neuro-pharmacology 56, 208–215.

　　4. Li,M., Wang, Y., Banerjee, R., Marinelli, F., Silberberg, S., Faraldo-Go ? mez,J.D., Hattori, M., and Swartz, K.J. (2019). Molecular mechanisms of human P2X3receptor channel activation and modulation by divalent cation bound ATP. eLife 8,e47060.

　　5.Cheewatrakoolpong, B., Gilchrest, H., Anthes, J.C., and Greenfeder, S. (2005).Identification and characterization of splice variants of the human P2X7 ATPchannel. Biochem. Biophys. Res. Commun. 332, 17–27.