CellResearch：一類全新植物異染色質蛋白

　　研究人員發現一類植物特有的新型組蛋白甲基化閱讀器ADCP1，并確定其為動物HP1（Heterochromatin Protein 1，異染色質蛋白1）功能同源蛋白，揭示出其在植物異染色質維持和轉座子元件沉默中的作用，彰顯了不同生命界中表觀機制的復雜性和保守性。

　　2018年11月13日，清華-北大生命聯合中心成員李海濤課題組攜手孫前文課題組、李丕龍課題組在Cell Research雜志在線發表題為“Plant HP1 protein ADCP1 links multivalent H3K9 methylation readout to heterochromatin formation”（植物HP1蛋白ADCP1關聯多價態組蛋白H3K9甲基化識別并介導異染色質形成）的合作研究成果，發現一類植物特有的新型組蛋白甲基化閱讀器ADCP1，并確定其為動物HP1（Heterochromatin Protein 1，異染色質蛋白1）功能同源蛋白，揭示出其在植物異染色質維持和轉座子元件沉默中的作用，彰顯了不同生命界中表觀機制的復雜性和保守性。

圖1、ADCP1識別組蛋白H3K9me2修飾介導異染色質形成

　　HP1是一類從裂殖酵母到人都保守存在的異染色質蛋白，它含有一個識別組蛋白H3K9甲基化修飾的chromo結構域和一個能自身二聚并介導與其他蛋白互作的chromoshadow結構域，在組成型異染色質形成和維持過程中發揮著重要作用。令人吃驚的是，如此重要的表觀因子在植物中卻未見報導。擬南芥中，HP1序列同源蛋白LHP1主要識別組蛋白H3K27甲基化修飾，從功能上發揮了類似于動物中多聚梳（Pc）家族成員（主要調控兼性異染色質形成）的作用。那么植物中是否真正存在與動物HP1功能類似，通過識別組蛋白H3K9甲基化來調控異染色質功能的蛋白呢？圍繞這一科學問題，李海濤課題組及合作者曾相繼開發了基于表面等離子體激元共振成像（SPRi）的微陣列篩選平臺(Zhao et al., PNAS 2017) ，并對擬南芥中潛在的閱讀器結構域進行了系統表征 (Zhao et al., Cell Rep 2018) 。在最新的工作中，研究人員基于SPRi平臺篩選出一類識別H3K9甲基化并且為植物所特有的串聯Agenet結構域蛋白：ADCP1 (Agenet Domain-Containing Protein 1)，發現ADCP1雖然與動物HP1不存在序列同源性，但其對于組蛋白的識別性質、結構基礎、異染色質功能調控和相分離行為等都與動物HP1有著高度相似性，呈現出一種功能同源的趨同進化分子設計。

　　ADCP1本身是一個三重串聯Agenet結構域蛋白，在植物中高度保守并且廣譜表達。基于SPRi篩選并結合等溫量熱滴定（ITC）實驗，研究人員確定了ADCP1的三個串聯Agenet結構域都是位點特異性的H3K9me2（組蛋白H3賴氨酸9二甲基化）修飾閱讀器并且可以被臨近的H3S10ph（組蛋白H3絲氨酸10磷酸化）修飾破壞結合。通過修飾多肽復合物晶體結構解析，研究人員闡明了ADCP1識別組蛋白H3K9me2的分子基礎，并開展了突變體實驗完成了驗證。在解析的復合物晶體結構中，ADCP1串聯Agenet結構域呈現出一種獨特的整體折疊和多肽識別模式（圖1）。其中每個串聯Agenet結構域中的兩個Agenet單體以“頭碰頭”方式擁簇堆積，并借由一段氨基端α螺旋、一對羧基端β折疊片和一段鏈接兩個Agenet單體的脯氨酸loop所構成的疏水簇底座而穩定。組蛋白H3（1-10）多肽結合在遠離疏水簇底座的酸性表面，其中H3K9me2插入到第二個Agenet結構域的“芳香籠”（aromatic cage）被識別，而非修飾的H3K4插入到第一個Agenet結構域的酸性口袋被識別，同時H3多肽的4-7區段被誘導形成一小段α螺旋在兩個Agenet結構域接觸面處參與識別。ADCP1對H3K9me2的識別依賴于組蛋白H3K4及更近氨基末端的序列，而H3K9和H3K27臨近且保守的“ARKS”基序未參與關鍵識別，因此ADCP1對于H3K27位點完全沒有結合力，進而解釋了ADCP1對H3K9me位點識別的特異性。

　　在接下來的工作中，研究人員用免疫熒光染色和ChIP-seq實驗在植物體內證實了ADCP1與異染色質H3K9me2共定位（圖1）。ADCP1富集在著絲粒旁區異染色質及常染色體臂的異染色質補丁區等，偏好富集于較長的轉座子（>4kb），尤其是Gypsy LTR逆轉座子等。隨后，通過觀察adcp1突變體以及瞬時超表達ADCP1到原生質體的細胞核染色中心（chromocenter）凝聚狀態，研究人員發現ADCP1對異染色質染色中心的形成至關重要，它的缺失或者過量表達都會造成染色中心的解聚或彌散，且該過程依賴于對H3K9me2的識別。進一步的研究發現adcp1突變體中H3K9me2以及CHG/CHH甲基化水平顯著下降，并且激活了一些轉座子的表達。綜上所述，研究人員在擬南芥中的功能研究表明ADCP1是一類重要的植物HP1家族成員，對于異染色質形成、H3K9me2和CHG/CHH甲基化維持，以及轉座子沉默是必不可少的。

　　ADCP1內在的多價態H3K9甲基化識別能力及其在異染色質調控功能方面與動物HP1的相似性暗示其可能同樣具備介導異染色質相分離能力。相分離現象是生物體內觀察到的一類重要的生物物理現象，在諸多重要的生物學事件中發揮著重要調控功能，是當前生命科學領域的一個重要理論突破。多價態識別是相分離發生的重要物理化學基礎，由于帶有修飾的核小體念珠串是天然的多價態分子，而組蛋白修飾閱讀器也可以以高價態的狀態存在，因此染色質很可能在體內發生相分離的現象。近期在果蠅細胞和哺乳細胞中都有觀測到異染色質發生相分離的現象，而HP1這一蛋白在該過程中發揮了重要的支架成核作用 (Larson et al., Nature, 2017； Strom et al., Nature, 2017)。在本工作中，研究人員發現ADCP1具有內在自分相能力，并且通過構建具有H3K9甲基化修飾的多聚核小體串，證實了ADCP1以H3K9甲基化依賴的方式介導多聚核小體串相分離的能力（圖2）。進一步，研究人員還證明這種H3K9甲基化依賴的相分離發生可以被H3S10ph修飾破壞，提示了一種異染色質分相的“二元開關”負調控機制。

圖2、ADCP1介導H3K9甲基化多聚核小體串相分離

　　總體而言，雖然序列不同源，植物ADCP1表現出諸多與動物HP1的功能同源之處：1）同屬于“皇室家族”結構域成員；2）特異識別H3K9me修飾而不識別H3K27me3修飾；3）H3S10ph都會破壞與H3K9me的結合；4）都通過“芳香籠”實現對賴氨酸甲基化的識別；5）均具備多價態識別依賴的異染色質分相能力；6）均可靶向組成型異染色質并介導轉座子沉默。因此，本研究認為ADCP1發揮了多年來一直未被發現的植物HP1的功能，對植物異染色質形成和維持發揮著重要調控作用。考慮到ADCP1及其同源蛋白在植物中的高度保守性，本工作為ADCP1及其同源蛋白在其他植物，尤其是轉座子元件比例更高的水稻、玉米等戰略經濟作物的基礎與應用研究提供新的切入點和方向。

　　清華大學醫學院李海濤教授與生科院孫前文研究員、李丕龍研究員為本文的共同通訊作者。清華大學趙帥博士及博士生程玲玲、郜一飛、張柏超為本文共同第一作者。李海濤研究組負責完成了ADCP1的鑒定與分子機制解析工作，孫前文研究組負責完成了植物功能實驗，李丕龍研究組主導完成了相分離實驗。清華大學醫學院博士后鄭向東及博士生王亮在相分離實驗部分做出重要貢獻。本課題得到科技部國家重點研發計劃、國家自然科學基金委、青年千人計劃、清華-北京生命聯合中心、北京市結構生物學高精尖創新中心和清華大學自主科研基金的經費支持。數據收集與儀器設備得到上海同步輻射光源與“鳳凰工程”北京蛋白質基礎設施的大力支持與協助。