ClonePixTM 2系統提供了一種全新、快速評估哺乳細胞系GPCR靶蛋白表達水平的方法 1. 用哺乳表達系統快速評估GPCR靶蛋白的內源表達水平 2. 增加發現最優細胞反應器的可能性 3. 減少細胞系/抗體開發的時間—避免有限稀釋法 背景 哺乳細胞GPCRs的內源表達通常是非常低的，一般不超過3,000拷貝/細胞。這些內源表達水平足夠維護正常的受體功能，但在GPCR藥物發現的應用存在挑戰。大部分的篩選試驗要求更高濃度的功能GPCRs呈現在細胞表面。例如，結構的研究，小分子藥物設計和天然GPCR的功能抗體生產均需要GPCR表達水平是內源表達水平的幾個數量級。在“低等”生物中嘗試建立表達系統取得的成功非常有限，由于細菌的無效折疊；酵母的低產和桿狀病毒不正確的翻譯后修飾。這些挑戰激發了藥物發現應用中高表達GPCR蛋白哺乳細胞系的市場需求。 關于細胞系的開發，從轉染細胞庫中發現和篩選高表達GPCR克隆是非常有挑戰的。ClonePix技術是已被證明的，一步法快速篩選大量異源細胞（3周10,000個克隆）。由于極其大容量的細胞庫能夠被篩選，大大增加了發現最優細胞生產器的可能性。利用白光和熒光的原位成像技術，ClonePix 2系統具有足夠的靈敏性能夠檢測細胞表面有限表達的內源性蛋白。 方法 表達內源G蛋白偶聯毒草堿1膽堿受體（GPCR-M1）的轉染細胞系CHO-M1被選擇來演示ClonePix2系統檢測細胞表面表達蛋白的可行性。CHO-M1表達克隆用PE標記的抗-M1的抗體來篩選，ClonePix2基于熒光強度選擇和挑選細胞。野生型的CHO-K1細胞系作為陰性對照。客觀評價細胞生長及無標記技術的CloneSelect Imager系統，用來監控ClonePix2系統挑選細胞的增殖。FLIPR Tetra高通量細胞篩選系統和FLIPR Calcium 6試劑盒用來驗證ClonePix2系統分離細胞克隆的功能。 FLIPR Tetra系統使用鈣敏感熒光報告染料進行高通量功能細胞測定，是藥物發現研究中評估GPCR激活引起的胞內鈣反應的首選工具。 材料
1. 細胞系：CHO-M1細胞系，表達內源G蛋白偶聯毒草堿1膽堿受體（ATCC,M1 WT3-CRL1985）. 親本CHO-K1細胞用作陰性對照。
2. 抗體：兔抗ChRM1-PE標記，多抗（Bioss，Cat.#ABIN668656）; 兔抗-CHRM1 多抗，無標記；（Bioss，Cat.#bs-1150R）; 山羊抗兔IgG-PE標記，多抗（Life Technologies, Cat.#P2771MP）。
3. 培養基：Ham’s F12培養基（Corning cellgro, Cat.#10-080-CV）；CloneMedia-CHO-S (Molecular Devices,Cat. #K8710); Fetal Bovine Serum (Hyclone, Cat.#SH30071.03), 1% Pen/Strep/Glutamine (Life Technologies,Cat. #10378016), 450 μg/mL Geneticin, G418 (LifeTechnologies, Cat. #10131035)。
4. 反應緩沖液：10X HBSS (Life Technologies, Cat.#14065056) 無菌水稀釋，注射用。(Irvine Scientific, Cat. #9309)，20 mM HEPES (Life Technologies, Cat. #15630080). pH 調整到7.4。
5. FLIPR? Calcium 6 Assay Kits (Molecular Devices, Cat.#R8190)。
6. 微孔板: 6-well non-TC treated, clear-bottom plates (Greiner Bio-One, Cat. #657185); 384-well black-wall, sterile,TC-treated, clear-bottom plates (Corning, Cat. #3072)。
7. M1 AChR agonist: Carbamoylcholine chloride or Carbachol(Sigma, Cat. #C4382)。
儀器概述 ClonePix 2 系統 1. 篩選和挑取哺乳細胞克隆的自動化系統 2. 白光和熒光成像 3. 透射光支持低對比度克隆如單層貼壁細胞成像 4. 軟件控制5對激發/發射濾光片的切換 5. 用戶自定義標準進行克隆排序 6. 目標克隆識別和挑取到96孔目標板 7. 支持懸浮和貼壁細胞的多種應用 1. 篩選和挑取分泌抗原特異性抗體的雜交瘤細胞 2. 細胞系開發 CloneSelect Imager 1. 無標記的白光細胞成像技術 2. 客觀、定量評價細胞生長 3. 簡單、容易使用的軟件界面 4. 準確獲取96孔板每個孔細胞的生長率 5. 支持多種應用： 1. 監控細胞生長 2. 單克隆驗證 FLIPR Tetra 系統 1. 標準EMCCD熒光檢測或可選ICCD熒光和化學發光檢測 2. 用戶可配置96-、384-、和1536孔板 3. 用戶可更換的懸浮細胞選項 4. 獨特的，可配置激發光學拓展了熒光種類的應用 5. 直觀、容易使用的軟件界面 半固體培養基培養細胞 CHO-M1和CHO-K1細胞系：CHO-M1和親本CHO-K1細胞種在CloneMedia CHO（K8710）培養基中，每孔1000個細胞，37℃培養8-10天直到離散克隆形成。新傳代的細胞和前幾代的細胞分別種在培養基中，觀察M1 GPCR的不同表達水平。 直接標記的方法：PE標記的CHRM1抗體隨細胞直接加到半固體培養基中。對照孔包括細胞但是沒有抗體。 雙抗體方法：直接標記的方法沒有效果的時候，用一抗和二抗測試可行性。非標記的rabbit anti-muscarinic抗體和PE標記的抗兔多克隆二抗隨細胞直接加到半固體培養基中。對照孔包含細胞但沒有抗體，連同僅僅含有二抗的對照孔。