擴增效率低：反應條件不夠優化。設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。
PCR 各種反應成分的降解或加樣量的不足。
PCR 產物太長： 一般采用 80～150 bp 的產物長度。
