采用 CytoFLEX 流式細胞儀上的紫光側向散射光，有利于進行亞微顆粒分析和計數

背景和目標

基于 FCM 的納米顆粒（SMP）檢測需要特殊的散射光參數設置。該參數的設置和標準化可以用微球作為 QC 工具實現。

目標：采用流式細胞儀 (FCMr) 對 SMP 進行分析和計數。

● 采用微球對最有用的散射參數（FSC 或 SSC）進行測定

● 采用先前的標準化設置（1、2）對其標準化效果進行測試

● 對比藍光和紫光 SSC 的散射靈敏度和分辨率

● 確認采用質控微球檢測散射分辨率得到的增益值，是否會使檢測細胞源微顆粒（MP ，亦稱為 EV）具有較高靈敏度檢測出現靈敏度增益值。

● 測試體積法絕對計數。

方法

質控微球：帶熒光的大小校準過的聚苯乙烯珠混合物（1、2）。Mgx + FSC：100 nm – 300 nm – 500 nm – 900 nm 微球， 適用于以 FSC 觸發檢測微顆粒的 FCMr（例如，具有 W2 的 B.C.Gallios/Navios、Astrios、帶 PMT-FSC 的 BD FACS-SORP、Influx）。

Mgx + SSC：160 nm – 200 nm – 240 nm - 500 nm 微 球，適用于以 SSC 觸發檢測微顆粒的 FCMr（其他熒光微球， 例如，B.D.FACS & LSR、Apogee A50、Stratedigm、MacsQuant、… 1）。

Gigamix = 兩種 Mgx+ 的 v/v 混合物。其他熒光 75 nm 微球。

細胞源的微顆粒：無血小板血漿中的 PMP (CD41/AnnV)（正 常 供 體）；TF+ MP (SBTF1-PE/AnnV-F) & EPC-MP (CD59-PE/AnnV-F)，從 BxPC3 胰腺癌細胞和血管內皮祖細胞培養液中純化并提取出來。

結果

1. CytoFLEX 采用 SSC 而非 FSC 標準化策略 (C & D vs G)

2. Violet SSC → 對微球 < 200 nm 和低背景噪聲的分辨率率提高 (D)。vSSC 閾值較低，可以適用于低于 75 nm 的微球。（E、F）。

3. SSC 或 vSSC 使用閾值值為 170 nm 的 SSC 標準化設置 (G)，以及 FSC 使用閾值為 300 nm 的設置 (F) ，獲得相似 PMP 計數。 CytoFLEX vSSC 截斷值為 100 nm →PMP 計數值較高 (G)。

4. 降低 vSSC 閾值 → MP-TF 和 EPC-MP 計數高于實際標準（K、L）。

結論

1. Megamix-Plus 和 Gigamix 是非常有用的、評估新 FCMr 的質控工具。

2. 采用 CytoFLEX 時，可以通過 SSC 488 進行 SMP 分析， 但最佳方式是采用 SSC 405 (vSSC)。

3. VSSC 參數對 75nm 和 100nm 的微球分辨率很高。

4. 當 vSSC 閾值小于等于 100 nm 時，可對 MP 樣品進行分析。

5. 較低 SSC 觸發閾值 →更多 MP（參見各種類型）

采用體積法計數可以獲取令人滿意的數據（摘自摘要的新數據 #）

A) 散射光信號觸發觸發：FSC 或 SSC ？

采用兩組 FCMr 進行 SMP 分析：有些使用 FSC 時表現最佳， 而其他一些則在使用 SSC 時分辨率更佳（有些則同時具備這兩項優勢，1）

相同 MP（例如，PMP 子集）位于 FSC 和 SSC 的不同位置。塑料微球是非常有用的質控工具，能夠以可再現的方式設置 FCMr，但是無法提供 MP 的絕對大小信息（取決于折射率）。

B) SMP 儀器評估以及質控

1. 儀器是否在標準化條件下運行？

2. 哪一項為優選散射參數？
FSC 或 SSC ？→ 遵照右側的組織結構圖 (從 1 補充物料開始)。確認 FCMr 是否適合使用標準化條件后：

參考文獻：

1.Poncelet P, Cytometry A, 2016 ; 89: 148-58.

2.Poncelet P, Transfusion & Apheresis Science, 2015, 53: 110-126.

C) 用藍光對 CytoFLEX 進行初始質控

1. FITC 熒光信號觸發觸發 + Gigamix

2. → 藍光 SSC 可以接受（非最佳）

3. → FSC 不可接受 (S.I. 500 –300 nm << 3.0)

4. 轉至藍光 SSC 觸發，約 170 nm（標準）

5. 過濾后的水進樣操作：約為 10,000 events/s，且可接受丟棄率約為 10%。

6. Violet-SSC → MP 分析靈敏度高于藍色 SSC ？→

D) 用紫光對 CytoFLEX 進行二次質控

1. FITC 熒光信號觸發觸發 + Gigamix

2. → 紫光 SSC：300 nm 以下時，分辨率較高

3. 轉至 vSSC 觸發，約 170 nm（標準）

過濾后的水進樣操作：< 10 events/s，丟棄率 < 1%。

E) CytoFLEX vSSC 可分辨 75 nm 微球

1. FITC 熒光通道信號觸發觸發 + Gigamix

2. 加入熒光 75 nm 微球

3. 75nm& 100 nm 微球間距較大

4. # 來自藍光 SSC：75 nm ~ 100 nm。

5. 注意原始 1：數使用（B 從.C. Kaluza v1.5 重新處理獲自 CytoFLEX

6. 注使意用 2：CytoFLEX 日常質控在 vSSC 設置中不適用！→ Gigamix 進行 SMP 應用的質控操作。

F) CytoFLEX vSSC → 觸 發<75 nm-eq.

1. vSSC 觸發 & Gigamix + 75nm μS

2. 閾值低于 75nm 微球

3. 使用 H2O 作為樣本時可接受背景噪聲最大。

*)<20k events/s，與約為 50k/s 的電子處理量進行對比。

4. 在 vSSC（峰值 < 75 nm）中的背景噪聲事件率要比藍光 SSC（峰值約為 100 nm）的低很多。

5. 75nm 與 100 nm 微球之間峰距寬 → 高分辨率。

6. 低于 170 nm 的標準化策略有待創建