1．外周血單個核細胞的采集
1.1 用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞80 - 100ml；
1.2 淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞(PBMC)；
1.3 無血清培養液洗滌2次，獲得純度在90%以上的PBMC，細胞數量需達到1-3 x 108。
2．(可選步驟)腫瘤抗原的制備]
用于負載DC的腫瘤抗原可以是腫瘤特異性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或腫瘤相關抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是腫瘤全細胞抗原。
用TSA或TAA負載的DC具有很好可克服這些缺陷，因為此時無需知道那些抗原是腫瘤細胞的TSA或TAA，而且全抗原中的多種不同腫瘤抗原沖擊DC可誘導產生針對不同抗原決定簇的細胞毒T淋巴細胞(CTL)克隆，從而實現對腫瘤細胞的有效殺傷。
腫瘤細胞全抗原負載DC的方法很多，包括用腫瘤細胞裂解液負載DC、用凋亡腫瘤細胞負載DC、用壞死或死亡的腫瘤細胞負載DC，用腫瘤活細胞負載DC，和將腫瘤細胞與DC融合等。目前臨床上常用的是用腫瘤細胞裂解液負載DC，因該方法簡單、快速、有效。
反復凍融是獲得腫瘤細胞裂解液的常見方法，具體步驟如下：
2.1 手術切除腫瘤標本，無菌條件下，將壞死組織和癌旁非腫瘤組織去除干凈；
2.2 無菌生理鹽水洗3次；
2.3 用無菌的組織剪將腫瘤組織剪碎，加入RPMI 1640培養基，充分研磨；
2.4 200目無菌網過濾后收集單細胞懸液；
2.5 用RPMI 1640培養基重懸細胞至1-2 x 107/ml，裝入5ml無菌凍存管中；
2.6 將凍存管浸入液氮中速凍，10 min后取出，再迅速放入37℃水浴中解凍10 min。反復3-5次；
注：也可以-80℃/37℃反復凍融3-5次。
2.7 將腫瘤裂解物加入離心管中，3000rpm，離心10min；
2.8 收取上清，0.22μm濾膜過濾除菌，留樣檢測蛋白含量及細菌、真菌和支原體；
2.9 -80℃保存備用。
3.0 CIK細胞的培養及鑒定
3.1 步驟1中獲得的PBMC 用無血清培養液調整細胞濃度至2 x 106/ml，置于培養瓶內；
3.2 37℃，5%CO2培養箱中孵育2h，以使單核細胞貼壁；
3.3 收集懸浮細胞，用無血清培養液調整細胞濃度至1-2 x 106/ml；
3.4 加入1,000 U/ml 的重組人IFN-γ培養；
3.5 24h 后加入50ng/ml 的CD3 單克隆抗體和300 U/ml 的重組人IL-2，刺激CIK 細胞的生長和增殖；
注：此時也可同時加入100U/ml的重組人IL-1a。
3.6 每3天半量換液或擴瓶一次，并補加重組人IL-2300 U/ml；
3.7 在培養的第7d，收獲CIK細胞,此時數量應達到1x109個以上；
3.8 CIK細胞質控：
3.8 .1臺盼藍染色檢測細胞活力：活細胞應在80%以上；
3.8 .2用流式細胞儀檢測細胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表達，觀察CD3+CD56+細胞的比例是否明顯提高。
4.DC細胞的培養及鑒定
4.1 步驟3.2中剩下的貼壁細胞(主要是CD14+的單核細胞)，加入含重組人GM-CSF 500-1,000U/ml和重組人IL-4 500U/ml的無血清培養液，37℃，5%CO2培養箱中培養，誘導單核細胞向DC細胞分化；
4.2 每3d 半量換液一次，并補足細胞因子；
4.3 (可選步驟)?在培養的第5d, 加入步驟2中獲得的腫瘤抗原50 mg/ml，對DC進行抗原負載；
注：若不對?DC?進行抗原負載，該步省略。
4.4 在培養的第6d，加入重組人TNF-α(500U/ml)，誘導DC細胞成熟；
4.5 在培養的第7d或第8d，收獲DC 細胞，其數量應達到1×106個以上；
4.6 DC的質檢：
4.6 .1臺盼藍染色檢測細胞活力：活細胞應在80%以上；
4.6 .2流式細胞儀檢測DC 細胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表達以確定DC是否成熟。