1、應用范圍
此ELISA試劑盒可用于人血清中二氫睪酮的定量檢測。注：僅供體外診斷用。
2、實驗原理
此ELISA試劑盒采用的是典型的競爭法。標準品、質控品和病人樣品中的未標記抗原和酶標抗原競爭結合包被板上有限的抗體結合位點。洗板以除去未結合的物質。洗板后，加入酶底物液。最后加入終止液以終止酶反應，并在酶標儀上讀取OD值。包被孔中溶液所顯示的顏色與樣品中DHT的量成正比。實驗中所用的標準品可作一條標準曲線，我們可以直接從標準曲線上讀取樣品和質控品中DHT的量。
3、臨床應用
5α-二氫睪酮（DHT）是一種類似于睪酮和雄烯二酮的類固醇激素，屬于雄性激素類。 DHT是一種含19個碳的類固醇，并具有雄性激素的活性。雄性激素主要由睪丸的萊迪希細胞分泌。循環于血液中的雄性激素會結合到一些蛋白質上，尤其會結合到SHBG（性激素結合蛋白）和清蛋白上。只有極少一部份以未結合的形式存在于血液中，被稱為游離部份。DHT對SHBG的親和力是睪酮對SHBF親和力的3倍。在男性中，有70％的DHT是由外周睪酮轉化而來；而在女性中，大多數DHT是由雄烯二酮轉化而來。肝是抑制雄性激素功能的主要器官。因此，類固醇激素在肝中都會發生結構改變，人們普遍認為這各種結構改變是其生物活性喪失的必要條件。在到達腎排泄前，此種類固醇會形成一些代謝產物，而有些類固醇又會回到血液循環中。因此，人體內的類固醇激素是通過尿液排出體外的。臨床傾向：在克蘭費爾特綜合征中，DHT的水平比正常人的要低很多。在先天性多毛癥患者中，有40％以上患者的DHT水平都會升高。在多囊卵巢患者中，大約35％患者的DHT水平會升高。成年人的DHT水平比正常老年人的DHT水平要高很多，因此雄性激素在青春期的分泌量會增加，這樣它就可以促進男性第二性征的形成。人們已經證實:人睪丸的生精小管可產生DHT。因此，在生精小管受損時，DHT的生成就會受阻，從而導致血漿DHT水平降低（例如：生殖細胞不發育癥和精子缺乏癥患者）。無睪畸形患者的血漿DHT的水平就非常低。據報道：在一些前列腺癌患者中（特別是第四階段），DHT的檢測有益于預測抗雄性激素治療的治療效果。
4、樣品的采集與儲存
進行一次雙份檢測大概需要0.2ml血清。采集4-5ml血液到相應的標記試管中，并待其凝血，離心獲取血清。4℃下可穩定存放24個小時，如果實驗過幾天再做，可將樣品凍存-10℃的環境或更低溫度下。
5、樣品預處理
此檢測系統是一直接檢測系統，不需要進行任何樣品預處理。
6、實驗所需器材但試劑盒不提供
1）移液器，50；100；150和300μl
2）取樣吸頭
3）蒸餾水或去離子水
4）搖床
5）酶標儀
7、試劑盒成份
1）兔抗DHT抗體包被的可拆包被板，即用。內含：抗DHT抗體包被的96孔包被板，密封于含干燥劑的包半裝袋中，儲存：冷藏于2-8℃的環境下，穩定性：12個月或標簽上的有效期。
2）HRP標記的DHT酶聯物，50倍濃縮型，內含：HRP標記的DHT酶聯物、蛋白緩沖液和無汞防腐劑，體積：200μl/支，儲存：冷藏于2-8℃的環境下，穩定性：12個月或標簽上的有效期，制備：使用前用檢測緩沖液按1：100的比例進行稀釋（例如：20μl HRP酶聯物中加入2ml檢測緩沖液。如果整個包被板都使用，可以用12ml檢測緩沖液稀釋120μl HRP酶聯物，棄去剩余試劑。
3）DHT標準品，即用。6支，內含：DHT、人血清白蛋白和無汞防腐劑，用緩沖液和一定量的DHT制備而成。下表為標準品的大概濃度，具體濃度請見試劑瓶標簽：
標準品 | 濃度 | 體積/支 |
標準品 A | 0 pg/ml | 2.0 ml |
標準品 B | 25 pg/ml | 0.6 ml |
標準品 C | 100 pg/ml | 0.6 ml |
標準品 D | 500 pg/ml | 0.6 ml |
標準品 E | 1000 pg/ml | 0.6 ml |
標準品 F | 2500 pg/ml | 0.6 ml |
儲存于2-8℃的環境下，穩定性：12個月或標簽上有效期，一旦打開，所有的標準品都必須在14天內用完或將其凍存，避免反復凍融。
4）質控品，即用，1支，內含：DHT、人血清白蛋白和無汞防腐劑，用緩沖液和一定量的DHT制備而成，具體濃度及可接受范圍請見試劑瓶標簽。體積：0.6ml/支，儲存：冷藏于2-8℃的環境下，穩定性：12個月或標簽上的有效期，一旦打開，所有的質控品都必須在14天內用完，必免反復凍融。
5）濃縮冼滌液，10倍濃縮型，1支，內含：緩沖液、非離子型去垢劑和無汞防腐劑，體積：50ml/支，儲存：冷藏于2-8℃的環境下，有效期：12個月或標簽上的有效期，制備：使用前用蒸餾水或去離子水按1：10的比例進行稀釋，如果整個包被板都使用，可用450ml蒸餾水稀釋50ml濃縮冼滌液。
6）檢測緩沖液，即用，1支，內含：蛋白緩沖液和無汞防腐劑，體積：15ml/支，穩定性：12個月或標簽上的有效期。
7） TMB底物液，即用，1支，內含：TMB、過氧化氫和非DMF或DMSO，體積：16ml/支，儲存：冷藏于2-8℃的環境下，穩定性：12個月或標簽上的有效期。
8） 終止液，即用，1支，內含：1M的硫酸，體積：6ml/支，儲存：冷藏于2-8℃環境下，穩定性：12個月或標簽上的有效期。
8、實驗步驟
樣品預處理：無
使用前必須將所有的試劑都平衡到室溫，標準品、質控品和樣品都必須作雙份檢測，一旦實驗開，所有的步驟都必須完整的進行下去。
1）制備好即用型的HRP酶聯物和檢測緩沖液。如果用尿液作實驗，應將尿液稀釋好。
2）取出所需數目的板條，將不用的板條重新密封于包裝袋中并冷藏。
3）將標準品、質控品和樣品（血清或已稀釋好的尿液）分別50μl加入到相應的微孔中（雙份檢測）
4）在每一微孔中加入100μl酶聯物（建議您使用多道移液器）。
5）室溫環境下，在包被板搖床上（200rpm）溫育1個小時。
6）每孔用300μl洗滌液洗板3次，并在吸水紙上拍干。
7）以相同的時間間隔，在每一微孔中加入150μl TMB底物液。
8）室溫環境下，在包被板搖床上溫育15-20分鐘。
9）在每一微孔中加入50μl終止液。
10）加終止液后20分鐘內450nm處讀取OD值。
*如果OD值超過450nm濾光片的檢測上限，我們可用405n或415nm代替，OD值可能會比較低，但它并不會影響樣品和質控品的實驗結果。
9、結果計算
1）計算兩個標準品OD值的平均值。
2）在半對數坐標紙上，以平均OD值為Y軸、標準品的濃度為X軸作一條校準曲線。如果使用免疫檢測軟件，我們可以作四參數曲線。
3）計算每一未知樣品OD值的平均值。
4）直接從標準曲線上讀取樣品的濃度。
5）將獲得的樣品濃度值乘以稀釋因子。然后乘以24小時尿液的體積，從而其閃單位可變為pg/24小時。最后將pg/24小時除以106，相應的單位就變成μg/24小時。
6）如果血清樣品濃度高于2500pg/ml,我們可以用標準品A將其進行稀釋（但稀釋比例不高于1：8）。則其結果應乘以相應的稀釋因子。
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。